吴静鸣，黄晓青，曹阳，黄顺旺

作者单位：1安徽天星医药集团有限公司，安徽 合肥230601；2合肥创新医药技术有限公司，安徽 合肥230088

在妇科领域，中医药在长期的临床治疗实践中积累了丰富的经验，有较为独特的治疗优势。子宫肌瘤是育龄妇女生殖系统中的最常见的良性肿瘤，发病率高达20%～30%，中医药通过辨证论治对机体内环境进行整体调节，有效抑制子宫肌瘤的形成和发展，可以更好地满足临床治疗需求。参白散结颗粒来源于医院临床验方，临床应用多年，数万病例，疗效确切，安全可靠，处方由党参、白芍、益母草、白术、茯苓、炙甘草等九味药材组成，具有疏肝理气，活血散结的功效，主治气滞血瘀型子宫肌瘤、卵巢囊肿。

原方用以汤剂，使用不便，为此，我们将汤剂改为颗粒剂，为了保证与原汤剂物质基准的一致性，提取工艺仍采用水提，根据处方中党参、炒白芍、益母草、白炒术、茯苓、炙甘草等九味药材所含成分的理化性质［1-6］，本研究自2018年1月至2019年6月采用正交试验设计优选参白散结颗粒中党参、炒白芍等九味药材的最佳水提工艺。以处方中臣药炒白芍中主要有效成分芍药苷为指标［7］，结合提取得膏率优选该颗粒剂的水提工艺，为该颗粒剂生产工艺提供试验依据。

1 试药与仪器

1.1 实验试药 党参（批号180412）、白芍（批号180603）、益母草（批号180505）等九味药材均购自安徽普仁中药饮片有限公司，经鉴定符合《中国药典》2015年版一部相关项下规定。芍药苷对照品（批号110736-201713，含量测定用）购自中国食品药品检定研究院，乙腈、甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，磷酸等试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备 微压循环中药煎药机（北京东华原医疗设备有限公司）；HL-SHZ-95 循环水式真空泵（河南巩义市英峪仪器厂）；RE-200E旋转蒸发仪（上海东玺制冷仪器设备有限公司）；HH-2K4一列回孔智能水浴锅（巩义市予华仪器责任有限公司）；湘仪L-550 型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Waters高效液相色谱仪；Waters-2998紫外检测器；Waters Empower 色谱工作站；6010 紫外-可见分光光度计（安捷伦科技上海有限公司）；AR1140 型电子天平（上海加惠仪器仪表有限公司）；CQF-I-6超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器公司）；真空干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。

2 水提取工艺

2.1 药材吸水率试验 为了提高正交试验加水量的准确度，对药材的吸水率进行考察。按处方配比称取党参、白芍等九味药材，加入10倍量水，密闭浸泡12 h，滤过，量取滤液，计算吸水率（%），实验结果见表1。由表1可见，药材的吸水率约为自身重量的1.9 倍，因此，在正交试验第一次提取时，需多加1.9倍量的水煎煮。

表1 吸水率测定表

2.2 正交试验设计［8-15］以浸膏得率、芍药苷含量为指标，选择加水量、煎煮时间、煎煮次数三个因素，每个因素选择3 个水平，选用L9（34）正交设计，因素水平见表2。

表2 水提取因素水平表

2.3 药材的提取及浸膏得率的测定［7］按表2设计9 组试验，按处方配比称取党参、白芍等九味药材9份，每份382 g，根据正交试验设计的条件进行提取，为提高煎煮效果，将药材加水浸泡1 h使其浸透后，煎煮，合并提取液，滤过，滤液浓缩，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，70 ℃减压干燥至恒重后，称重，计算浸膏得率。

2.4 浸膏中芍药苷含量测定［8-13］

图1 高效液相色谱图：A为对照品，B为供试品，C为阴性对照

2.4.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱条件：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色谱柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；柱温为25 ℃；流动相为乙腈：0.1%磷酸（14∶86）；检测波长为230 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为10µL；理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。

2.4.2 对照品溶液的制备 取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含60µg，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取样品研细，取约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加稀乙醇35 mL，密塞，精密称定重量，超声处理（功率250 W，频率25 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45 µm）滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 阴性样品溶液的制备 按处方组成，取除白芍外其余药材，按制剂工艺制成阴性样品，按“2.4.3”项下方法，制成阴性对照溶液。

2.4.5 干扰试验 按照“2.4.1”项色谱条件，将对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10µL 分别进样测定，结果：供试品中芍药苷的色谱峰与相邻色谱峰达到基线分离，阴性对照无干扰，见图1。

2.4.6 标准曲线的制备 精密称取芍药苷对照品7.5 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取0.5、1、2、4、6、8 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，取续滤液，分别进样量10 µL，按照“2.4.1”项色谱条件测定，量取峰面积，以对照品浓度（µg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程Y＝13 128X-1 893.9，r＝1，结果表明：芍药苷在15～240µg/mL范围内线性关系良好。

2.4.7 精密度试验 精密吸取“2.4.2”项下的芍药苷对照品溶液10µL，注入液相色谱仪，在“2.4.1”项色谱条件下重复进样6 次，测得峰面积，计算得其RSD为0.12%，表明本法测定精密度良好。

2.4.8 重复性试验 取同一批号样品共6 份，按“2.4.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下测定，芍药苷的平均含量为1.12 mg/g，RSD为0.16%，本法重复性良好。

2.4.9 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10 h进样10 µL，测定芍药苷的峰面积，计算得其RSD为1.5%，表明本品在10 h内稳定。

2.4.10 加样回收率试验 取已知含量为1.12 mg/g的同一批号的样品细粉适量，精密称定，共6 份，分别加入定量芍药苷对照品，按“2.4.3”项下方法制备，在“2.4.1”项色谱条件下测定，并按外标法以芍药苷峰面积计算，平均回收率为108.00%，RSD为0.98%。

2.4.11 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，代入线性方程，计算芍药苷（C23H28O11）的含量。

2.5 正交试验方法与结果 由表3直观分析可知，以浸膏得率为考察指标时，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工艺条件为A3B2C3。以芍药苷含量为 考 察 指 标 时 ，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工艺条件为A3B2C3。

表3 正交试验设计及结果

由表4 方差分析可知，以浸膏得率为评价指标时，A因素、C因素均差异有统计学意义，B因素差异无统计学意义，且重要性依次为A＞C＞B；以芍药苷含量为评价指标时，A 因素和B 因素差异无统计学意义，C 因素差异有统计学意义，重要性依次为C＞A＞B。

综合考虑，水提最佳工艺为A3B2C3，即10 倍量（考虑药材吸水率，第一次多加1.9 倍量）水，煎煮3次，每次2 h。合并煎液，滤过，滤液静置，取上清液备用。

2.6 工艺验证 取3份药材（每份382 g），将A3B2C3组合平行试验3 次，结果浸膏得率分别为37.59%，37.83%，38.35%，平均值为37.92%，RSD 为1.02%；芍药苷的量分别为425.62 mg，430.37 mg，433.84 mg，平均值为429.94 mg，RSD为0.96%。

表4 方差分析

3 讨论

3.1 多基原药材的确定［7］本处方各味药材中，党参、炙甘草为多基原药材，本试验采用党参药材为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，炙甘草药材为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

3.2 含量测定指标的选择及转移率计算［1，3，7］本处方有由九味药材组成，党参为君药，炒白芍、益母草为臣药，炒白术、茯苓等为佐药。其中党参、白术、茯苓在中国药典标准项下暂未收载含量测定指标；在此处方中，在HPLC-ELSD 条件下益母草中的盐酸水苏碱、盐酸益母草碱与其它峰未得到较好分离，暂不作为考核指标；因此，我们选择炒白芍中的芍药苷作为含量测定指标，所选方法简便、准确、灵敏度高，可用于水提工艺的含量考察指标。投料药材炒白芍中芍药苷含量为1.24%，同时根据处方中炒白芍所占比例，计算出水提工艺得到的干膏中芍药苷的含量，其转移率稳定在75%左右，转移率高。本研究优选出的水提工艺稳定，干膏得率适中，主要有效成分转移率高，为参白散结颗粒的中试、大生产提供试验依据。