白晓晔，孙志宏，张和平*

（1．内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特010018；2.内蒙古农业大学 农业农村部奶制品加工重点实验室，内蒙古 呼和浩特010018）

肠道是个复杂的微生态系统，栖息着数以万计的微生物种群，包含细菌、真菌、古生菌、原生动物和病毒，它们的稳定平衡对于维持宿主健康至关重要，肠道菌群紊乱会引起各种临床疾病[1-2]，例如Ⅱ型糖尿病（type 2 diabetes）[3]、肥胖（obesity）[4]、炎症性肠炎（inflammatory bowel disease，IBD）[5]和慢性腹 泻（chronic diarrhea）等疾病[6]。大量研究表明，益生菌或可通过靶向肠道菌群使其维持稳态，进而保证宿主健康[7-11]。

益生菌（probiotic）是指服用适当剂量对宿主产生有益作用的活的微生物[12-13]，被认为是安全、无毒副作用的[14]。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类发酵碳水化合物产生乳酸、无芽孢、不运动或很少运动、过氧化氢酶呈阴性的革兰氏阳性细菌的总称[15]。在乳酸菌范畴中，最常用、最主要的益生菌多数隶属于乳酸杆菌，而Lactobacillus acidophilus，Lactoba-cillus casei，Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus helveticus是被广泛研究的几种乳酸杆菌[10]。益生乳酸菌不仅对腹泻、炎症性肠炎、乳糖吸收不良和早产儿坏死性小肠结肠炎等疾病具有临床益生功效[5，16-17]，而且还有助于缓解高压人群压力、焦虑，提高其记忆和认知力[18]，改善季节性花粉过敏健康人群的生活质量[19]。

虽然益生乳酸菌具有良好的益生功效，但是其益生机制还未达成共识。通常认为益生菌可通过增加肠道中有益菌、降低肠道中致病菌来调节肠道菌群结构来缓解被扰乱的肠道菌群，进而维护宿主健康[7-11]。而Sanders等[20]研究发现益生菌可减少肠道菌群变化幅度或促进失调的肠道菌群快速恢复正常，推测益生菌的益生功效是通过保护宿主肠道菌群免受破坏进而维持肠道菌群平衡，他们认为益生菌的主要作用是能够调控宿主肠道菌群处于稳定状态，不强调对肠道中特定菌群的影响[21-22]。益生乳酸菌如何调节和维持肠道菌群稳态还有待深入研究。作者阐述了益生乳酸菌对宿主肠道菌群稳态的影响，及其维持肠道菌群稳态的可能机制。同时指出了维持肠道菌群稳态的重要性及目前计算肠道菌群稳态的方法，并提出了目前益生乳酸菌研究中存在的不足及未来的研究方向。

1 肠道菌群稳态及其评估

肠道菌群是个非常复杂的微生态，其中的微生物种类繁杂、数量庞大。在不考虑研究对象的地理来源、体重指数、年龄或性别时，粪便的微生物群落聚集成了3种类型，即根据粪便中菌群结构将肠道分为3种肠型；如果考虑饮食、地理来源、健康状态、疾病类型等因素，肠道菌群似乎又是一个无序的微生态[23]。而且，目前对健康肠道菌群组成及结构的认知还有待进一步完善。虽然许多研究追踪了使用益生乳酸菌对肠道菌群的影响，试图计算或衡量益生乳酸菌对肠道菌群稳态的改变（见表1），但是“肠道菌群稳态”这一定义至今还无科学一致的定义。如何判断某一微生态是否失衡仍是一个挑战。

早在2007年，Jussi Vaahtovuo等为了简单明了地描述复杂的微生物群变化，开发了计算肠道中微生物平衡的指数（Microbial Balance Index，MBI），并在仔猪饲养试验中，观察到MBI与仔猪体质量日增长 量（daily weight gains，DWG）呈 正 相 关[24]。2017年，MK AlShawaqfeh等[25]发现，患有慢性炎性肠病的犬与健康犬相比，其肠道中存在一些差异性细菌，比如Faecalibacterium、Turicibacter、Escherichia coli和Streptococcus等，于是他们利用qPCR对这些差异菌群进行定量，使用不同数学算法构建了评估菌群改变的失衡指数（dysbiosis index，DI）。这种基于qPCR的失衡指数是基于最近原型（质心）分类器构建，并且在单个数值中显示失调的程度，该数值测量了受试样品与每个类别的“标准模型”的接近程度。换言之，就是受试样本与健康样本之间的欧几里得距离（Euclidean distance）和受试样本与疾病样本之间的欧几里得距离之间的差别。DI值为0意味着受试样本与健康样本和疾病样本的中心距离相等，DI值为负数时表示微生态正常，而DI值为正数时，表示微生态失调，且DI值越大表示失衡越严重。计算结果显示，患有慢性炎性肠病的犬的平均DI值为3.3，而健康犬的为-4.8，患有慢性炎性肠病的犬的DI值显著高于健康犬。

目前用于肠道菌群稳态评估较受认可的算法是2014年Gevers等[26]提出的微生物失衡指数（Microbial Dysbiosis index，MDI）。他们在推断回肠微生物群组成的相关网络时，发现同一疾病中的一些菌群是同时存在且同时增加或减少，而不同疾病中变化趋势是不同的。于是基于这一现象提出了MDI，即所有样品中丰度增加的细菌的总相对含量除以所有样品中丰度降低的细菌总相对含量，然后取对数得到的一个值，即微生物失衡指数。该MDI值源于疾病表型，与临床疾病严重程度呈显著正相关，与物种丰富度呈负相关。Sahil Khanna等[27]在研究粪菌移植对艰难梭状芽孢杆菌感染患者肠道菌群影响时，为了描述群落组成的变化，也使用了Gevers等提出的MDI，其中，MDI评估由18个分类群完成，包含了与IBD严重程度正相关和负相关的细菌群。结果发现艰难梭状芽孢杆菌感染患者肠道微生物失衡指数显著高于供体的。Kelly A.Shaw等[28]在分析IBD患者肠道菌群变化时，也引入了MDI，指出IBD患者肠道中微生物失衡指数显著高于健康对照组的。此外，在研究过程中，生态失调指数降低，与治疗和随后的临床改善一致；生态失调指数与PCDAI测量的临床严重程度显示出强烈的相关性。表明MDI可捕获IBD患者中微生物组的改变及其与疾病活动的临床和生化测量相关性。MDI除了用于评估肠道菌群是否失衡，2017年Rui M Ferreira等[29]还使用MDI对胃炎和胃癌患者胃黏膜菌群进行了分析计算，发现胃癌患者胃中MDI值较胃炎患者的高，且MDI与香农指数呈负相关，即胃癌患者胃中微生物较胃炎的失衡程度高。同时还发现，MDI可用于区分胃炎和胃癌，与使用单一分类群相比，MDI在检测胃癌方面表现出更高的灵敏度和特异性。

表1 肠道菌群稳态评估指数Table 1 Homeostasis index of gut microbiota

2 益生乳酸菌对肠道菌群稳态的影响

随着人类对基因认知的加深，肠道菌群这一“器官”逐渐受到重视。Sanders通过总结分析关于益生菌对肠道菌群影响的报道发现，肠道菌群失衡与许多疾病相关[30]。通常认为失衡的肠道菌群具有均一度和丰富度下降，有益菌降低、有害菌增加等特征[31-32]，而益生乳酸菌可通过增加肠道中有益菌的数量，改变细菌结构，降低致病菌及其毒素，加强肠黏膜屏障功能和细胞因子调节来缓解被抗生素或疾病扰乱的肠道菌群，进而维护宿主健康[7-11]。例如，肥胖患者肠道菌群多样性及Bacteroidetes/Firmicutes数量比值下降，丁酸盐产生菌和抗炎菌等有益菌丰度降低，而条件致病菌急剧增殖[33-37]。而复合益生菌Lactobacillus acidophilus、Bifidobacterium longum和Enterococcus faecalis可明显地重塑高脂肪和高蔗糖饮食大鼠肠道中细菌比例，增加与肥胖呈负相关细菌的丰度[33]。Park等[38]研究益生菌Lactobacillus curvatus HY7601和Lactobacillus plantarum KY1032对高脂诱导的肥胖大鼠肠道菌群影响时发现，与食用安慰剂的高脂饮食大鼠相比，益生菌组大鼠的肠道中Bifidobacterium pseudolongum的相对丰度比安慰剂组高约10倍，但是益生乳酸菌干预并不影响大鼠肠道优势菌门，Firmicutes和Bacteroidetes仍然是大鼠肠道中优势菌门。类似的，益生乳酸菌还可调节Ⅱ型糖尿病[39]、胆固醇高[40]、溃疡性肠炎[41]、肠易激综合征[42]、炎性肠病[43-44]和哮喘[45]、非酒精性脂肪肝[46]等疾病患者的肠道菌群结构，增加其肠道菌群中有益菌，改善其菌群功能多样性。此外，一些研究还报道了益生菌对健康人群肠道菌群的影响。比如，Matsumoto等[47]采用随机、双盲、安慰剂对照方法评估益生菌对健康志愿者粪便微生物群影响时发现，与未服用Lactobacillus casei Shirota发酵乳的志愿者相比，服用益生菌发酵乳后的志愿者肠道中总细菌数、共生双歧杆菌和短链脂肪酸（乙酸，丙酸和丁酸）显著增加。Ferrario等[48]指出，服用Lactobacillus paracasei DG补充剂增加了健康志愿者肠道中Blautia/Coprococcus数量的比率，且志愿者粪便菌群的整体结构显著改变。Kwok等[49]对摄入L.plantarum P-8的33名健康志愿者（老年组、中年组、青年组）肠道菌群进行分析发现，Lactobacillus plantarum P-8增加了肠道内有益菌的数量，降低致病菌的数量，使肠道菌群健康化，尤其对老年人肠道菌群的改善效果最为显著。

然而，有报道发现服用Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum或Lactobacillus rhamnosus虽然缓解了海马肠炎症状，但是其肠道菌群结构几乎没有变化，推测这些益生乳酸杆菌可能是通过促进肠道菌群稳态，抑制了弧菌捣乱[21]。Kajander等[22]研究服用混合乳酸菌菌株的肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）患者肠道菌群，发现其肠道中的细菌特定变化较小，也推测益生菌补充可能促进微生物群的稳定化。Kristensen等[50]系统分析了2015年8月之前关于益生菌对健康志愿者肠道菌群改变的报道后指出，服用益生菌对健康志愿者肠道菌群丰富度、均一性或α多样性无影响，并未显著改变其肠道菌群结构与组成。这可能是因为健康人群肠道菌群处于稳定平衡状态，益生菌对其肠道菌群结构及特征的作用较小。此外，Wang等[51]指出肠道微生态是个复杂多变的生态，肠道中改变的微生物并不一定与疾病改善相关。因此，评估益生乳酸菌益生功能不能仅局限于考虑其特定细菌组成变化，还要考虑整个肠道菌群稳态。

同时，研究益生乳酸菌对肠道菌群稳态还需要考虑菌株差异性。早期Yoo等[52]使用Lactobacillus plantarum KY1032和Lactobacillus curvatus HY7601两株菌在单独给药时，发现这2种菌株改善脂质代谢和全身性炎症的能力不同，但是未分别评估每株菌对肠道菌群的影响。此后Wang等[51]比较了Lactobacillus paracasei CNCM I-4270、Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690和Bifidobacterium animalis ssp.lactis CNCM-I2494三株单独的益生菌菌株对高脂诱导的代谢综合征小鼠生理和肠道微生物群落结构的影响。发现这3株菌均减缓了小鼠体重增加、葡萄糖耐受不良和肝脏脂肪变性，恢复了高脂饮食诱导的肠道菌群的改变，但是每株菌对宿主炎症和肠道菌群影响程度不同，它们会选择性地改变与代谢综合征发展显著相关的关键细菌物种子集。

3 益生乳酸菌调节肠道菌群稳态机制

具有益生功能的乳酸菌可通过以下几种方式调节宿主肠道菌群平衡：1）与肠道中病原菌竞争结合位点或分泌物质抑制病原菌；2）分泌代谢物为肠道中有益共生菌提供适宜生长繁殖的环境；3）刺激宿主免疫系统应答调节肠道菌群平衡，见图1。

图1 益生乳酸菌调节肠道菌群稳态机制Fig.1 The regulatory mechanism of lactic acid bacteria with probiotic function for the intestinal flora homeostasis

3.1 益生乳酸菌抑制肠道中病原菌维持肠道菌群稳态

维持肠道菌群稳态不仅需要肠道中共生微生物自身的稳定，还需要平衡外来入侵的致病菌。大量研究指出，食用具有益生作用的乳酸菌显著降低了宿主肠道中的食源性致病菌及其感染的严重程度，保护宿主的作用[53-59]。但是益生菌拮抗致病菌的活性作用，与传统的抗生素改变肠道中复杂微生物群落组成不同，益生菌仅对宿主肠道中微生物进行抑制和调控。此外，益生乳酸菌还可与肠道中病原菌竞争结合位点对其进行抑制。Johnson-Henry等[60]发现Lactobacillus rhamnosus GG能抑制致病性大肠杆菌O157∶H7对HT-29肠上皮细胞的黏附[60]，Mukai等指出益生乳酸菌还可通过增加肠道中双歧杆菌的丰富度竞争空肠黏膜上的沙门氏菌的定植位点[61]。此外，某些乳酸杆菌与几种肠道病原体共享碳水化合物结合特异性，这使得它们能够与那些病原体竞争宿主细胞受体位点[62-63]。它们还可以表达与Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）等跨膜宿主模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）结合的微生物相关分子模式（MAMP），从而通过竞争排除病原体[64]。此外，乳酸杆菌益生菌株还具有特异性吸附特性，能通过表面蛋白和黏附素之间的反应抑制致病菌的定植[65]。除了如上所述的竞争排斥之外，益生乳酸菌还可通过分泌蛋白质降解碳水化合物受体、建立受体类似物的生物膜和产生生物表面活性剂来抑制病原体黏附[66]。益生乳酸菌与致病菌竞争的程度还取决于菌株及它们的分布和黏附素对各自细菌表面的特异性受体和亲和力决定[67]。

3.2 益生乳酸菌产生代谢产物调节肠道菌群稳态

在维持肠道菌群稳态过程中，益生乳酸菌产生的代谢产物也发挥了重要作用。Tejero Sarinena等[68]发现，乳酸菌可通过产生乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等短链脂肪酸抑制如Salmonella enterica，Serovar typhimurium和Clostridium difficile等致病菌。肠道中产丁酸盐的细菌还可以将乳酸菌产生的乳酸转化为丁酸，这种短链脂肪酸（SCFA）在肠细胞中具有多种益处，对于肠内稳态至关重要[69]。此外，短链脂肪酸能够维持结肠中的pH值，使其维持在合适的范围，这对于肠道中众多细菌酶的表达以及肠道中外来化合物和致癌物质的代谢至关重要[70]。益生乳酸菌还可通过分泌如乳酸、醋酸和抗菌物质等物质抑制肠道中的致病菌[71]，改变它们生存的环境，使其竞争对手处于不利环境[72]。Macfarlane等[73]还发现益生乳酸菌可以在整个肠道中使用底物，或者提供可以原位分解底物的酶，从而影响共生细菌生长的所需底物。

3.3 益生乳酸菌刺激免疫系统维持肠道菌群平衡

肠道微生物群与宿主免疫系统之间的相互作用始于出生时，微生物群影响免疫系统的发育，免疫系统反过来塑造微生物群的组成[74]。益生乳酸菌除了直接影响宿主肠道中细菌菌群外，还刺激宿主抗病原体防御途径，例如刺激或激活防御素生成中涉及的途径，而防御素是小肠隐窝细胞和肠上皮细胞中的Paneth细胞等细胞产生的阳离子抗菌肽[75]，这种抗菌肽可以抑制肠道中致病菌。益生乳酸菌的抗原成分（例如细胞壁化合物）能够通过肠道上皮和Peyer氏斑块表面上的M细胞穿过肠道。当抗原分子穿过肠道时，它们可以刺激灵活的固有免疫系统，进而调节肠道菌群平衡[76-77]。类似的，益生乳酸菌还能刺激抗菌免疫活性减少肠道中某些微生物的数量，下调肠道炎症，促进有益于肠道生理的微生物[30]，加强肠上皮细胞紧密连接，降低细菌移位的发生[78]。益生乳酸菌还通过刺激上皮细胞的完整性来对抗肠道致病微生物的定植和增加黏膜的完整性[79]。

4 肠道菌群稳态的重要性

人类与肠道菌群共同进化了数百万年，随着抗生素大量使用、饮食过度精细而缺乏细菌可利用碳水化合物、过度注重卫生和剖腹生产等生活方式的改变，以及环境温度和昼夜规律变化，环境改变，人类肠道菌群发生了巨大改变[80-82]，破坏了人类与肠道菌群之间原有的共生平衡关系，伴随而来的是一系列如炎症性肠病，肠易激综合征、癌症、哮喘和糖尿病等慢性非传染性疾病的发生，这也暗示了肠道微生态改变可能是引了这些疾病的原因[80]。从代谢的角度来看，肠道菌群被认为是能够调节宿主生理和免疫的联合体[83]。Lin等[84]也指出肠道菌群失衡会引起免疫紊乱，进而引起代谢综合征（如肥胖、糖尿病胰岛素抗性等）、中枢神经系统紊乱（情感、认知障碍）和心血管疾病 （动脉粥样硬化）。此外，Larmonier等[85]在研究肠道菌群与骨骼健康时发现，肠道菌群失衡对宿主骨骼健康也有影响。肠道微生物还可通过模式识别受体（PRRs）影响局部和全身炎症[86-87]。因此，维持肠道菌群稳态是保证宿主健康的有力保障。

5 展望

益生菌应用日益广泛，不仅在医药和食品领域研究成果显著，在化妆品和生物高科技等领域也越来越受到重视。中国市场调研在线发布的中国益生菌市场现状调研与发展前景分析报告（2017-2023年）认为：“目前世界上益生菌产业每年的增长速度为15%～20%”，益生菌产业将是一个非常庞大的产业。目前研究和应用的益生菌大部分是乳酸菌，因此益生菌产业即益生乳酸菌产业。虽然益生乳酸菌应用前景广阔，但是关于其研究还有很多问题亟待解决。首先，并不是所有乳酸菌都能作为益生菌使用，能称得上益生菌的乳酸菌不仅要对宿主具有益生作用，耐酸耐胆盐，还要能在宿主应用位置或肠道中定植、存活并生长，且能够在适宜储存条件下维持其活性[88]，因此益生菌筛选和使用必须严格按照这些标准执行。其次，目前研究中益生乳酸菌使用量为1×108～1×1011CFU/（g·次），连续使用时间为2～16周，使用量和食用时间各不相同，益生乳酸菌的持续使用时间和使用量目前尚无定论，还有待商榷。此外，目前研究使用的益生乳酸菌菌株各不相同，健康的肠道菌群也不止一种模式，所以不存在一株适用于世界各国各民族人群、不同疾病的益生菌。亟须通过大量采集不同国家各个地区人群粪便，完善和构建肠道菌群大数据库，包括健康人群肠道菌群数据库、各种疾病特征肠道菌群数据库、不同民族和地域人群特有菌群数据库及全人类菌群数据库，以当地居民肠道菌群数据为基础，结合当地居民肠道菌群构成特点，筛选出符合当地居民的个性化益生菌。