张慧超，谭 奎，葛 琳，刘 丹，闫丽丽，刘 文，乔 华，解 军

(1. 山西医科大学a. 基础医学院，b. 出生缺陷与细胞再生山西省重点实验室，山西太原030001；2. 中国科学院山西煤炭化学研究所煤转化国家重点实验室，山西太原030001)

碳量子点(简称碳点，CDs)是一种粒径约为10 nm的新型碳纳米材料，形状为准球型[1-2]。研究[3-5]表明，CDs特殊的光学特性和优良的生物学性能使其在分析检测、药物传输及生物成像等方面具有良好的发展前景。近期，阳离子碳点(CCDs)的出现更拓宽了CDs的应用领域和范围。如Guo等[6]将CDs共掺杂N、S元素后，能得到表面电位为+20.29 mV的CCDs，可作为比率型荧光探针检测目标DNA。Zhou等[7]以海藻酸钠为碳源，将制得的CCDs用作磷酸化转移生长因子β受体1(PTGF-β1)的载体转染3T6细胞，转染效果优于常见的基因载体脂质体2000和聚乙烯亚胺(PEI)。

随着CDs在生物领域应用范围的不断拓展，它与血浆蛋白的作用研究越来越受到业界的广泛关注[8-10]。在生物材料与蛋白作用的众多研究方法中，光谱分析法是一种常用且简便、可靠的分析手段。人体纤维原蛋白(human fibrinogen，hFIB)是一种由肝脏合成的具有凝血功能的可溶性血浆蛋白，分子量为340 ku，含有2 964个氨基酸残基，等电点为5.5[11]。因为含有72个色氨酸残基，所以hFIB具有很强的内源性荧光，常采用内源荧光光谱并辅以圆二色谱进行构象变化研究。如蔡建周等[12]采用荧光发射光谱结合紫外光谱和圆二色光谱，研究了聚赖氨酸与hFIB的相互作用。Qiao等[13]利用内源性和外源性荧光光谱结合圆二色光谱，考察了阳离子与中性表面活性剂等摩尔复配体系对hFIB构象的影响。总之，采用多光谱联用技术能有效检测CCDs与hFIB的相互作用，但是相关研究内容鲜有报道。

本文中利用蔗糖和谷氨酸为碳源，PEI为钝化剂，制备CCDs，并利用透射电子显微镜、红外光谱、X射线光电子能谱、纳米激光粒度仪、紫外光谱和荧光光谱等对CCDs进行形貌和结构表征，研究CCDs与hFIB相互作用机理，探讨CCDs对hFIB构象的影响，以及两者相互作用的规律。

1 实验

1.1 仪器与试剂

主要仪器包括：JEM-2100F型高分辨透射电子显微镜(HRTEM)，日本电子株式会社；Varian FTIR-640型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)，美国瓦里安有限公司；Maldi-TOF-MS型质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；UV-1200型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器公司；ESCALAB 250Xi 型X射线光电子能谱仪(XPS)，美国赛默飞世尔科技公司；Cary Eclipse型荧光光谱仪，美国瓦里安有限公司；Zetasizer Nano ZS型纳米激光粒度仪，英国马尔文公司；圆二色光谱仪，法国Bio-Logic公司；AUY120 型电子分析天平，日本岛津公司；电热鼓风干燥箱，北京永光明医疗仪器公司。

主要试剂包括：hFIB(美国Bio Basic公司)溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)中，浓度为0.05 μmol/L，4 ℃温度条件下冷藏，备用；蔗糖、谷氨酸、PEI 2000(Solarbio公司，分析纯)。其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 CCDs的制备与表征

1.2.1 制备

将蔗糖和谷氨酸按照质量比10∶1混合，加入适当比例的PEI 2000，用30 mL蒸馏水充分溶解后，转移至反应釜中，在200 ℃温度条件下反应5 h。反应结束后，自然冷却至室温，得到黄棕色溶液，取出后超声振荡30 min，将溶液转移至50 mL离心管，在转速为12 000 r/min的条件下离心分离15 min，取上清液，用截留分子量为1 000 u的透析袋透析纯化24 h，得CCDs棕黄色溶液，冷冻干燥后制得CCDs棕色固体粉末，在4 ℃温度条件下贮存，备用。

1.2.2 表征

采用质谱仪测得合成CCDs的平均相对分子质量为1 000。称取少量CCDs 粉末，溶于超纯水中得到CCDs溶液，于纳米激光粒度仪上测定CCDs溶液表面电位。将CCDs溶液滴加于超薄碳膜铜网上，晾干；在加速电压100 kV时，用TEM观察CCDs 微观形貌。取少量CCDs粉末，用溴化钾(KBr)压片法制样，利用红外光谱仪考察其红外吸收特征。另取少量CCDs粉末进行XPS能谱测试，考察其表面功能团类型。

利用紫外分光光度计测定CCDs溶液的紫外-可见吸收光谱，以硫酸奎宁为参比，计算CCDs 的荧光量子产率。利用荧光光谱仪，在激发波长为300～500 nm时，每隔20 nm测定相应波长范围内CCDs的荧光发射光谱。

1.3 CCDs与hFIB相互作用的表征

1.3.1 荧光光谱和同步荧光光谱

准确移取3.0 mL浓度为0.05 μmol/L的hFIB溶液置于石英比色皿中，采用荧光滴定法，依次滴加CCDs溶液(浓度为0.3 mmol/L)，在预先设定温度(热力学温度分别为297、304、310 K)条件下，考察激发波长为278 nm、激发和发射狭缝宽度都为10.0 nm时，体系在发射波长为300～400 nm时的荧光发射光谱。设波长间距Δλ分别为15、60 nm，考察hFIB与CCDs作用的同步荧光光谱。

1.3.2 圆二色光谱

在室温条件下，以PBS缓冲液(pH=7.4)为空白扣除溶剂吸收峰，扫描CCDs与hFIB混合体系在波长为200～250 nm时的圆二色光谱，设定扫描速度为60 nm/min。

2 结果与讨论

2.1 CCDs的表征

采用HRTEM观察CCDs的形貌特征，对其粒径大小和分布进行统计分析，结果如图1所示。利用FTIR对合成的CCDs进行结构表征，如图2所示。

(a)透射电子显微镜图像

(b)高分辨率透射电子显微镜图像

(c)粒径分布图1 阳离子碳点的透射电子显微镜图像和粒径分布

图2 阳离子碳点的红外光谱

(a)XPS全谱(b)C 1s能谱(c)N 1s能谱(d)O 1s能谱图3 阳离子碳点的X射线光电子能谱(XPS)图

图4 阳离子碳点的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱

图5 阳离子碳点的激发依赖荧光光谱

Zeta电位测试结果显示，CCDs的Zeta电位为+28.7 mV，说明其表面带正电荷。而hFIB(等电点为5.5)在模拟生理条件(pH=7.4)时带负电荷，因此，理论上推测CCDs可以与hFIB通过静电作用力结合。

2.2 CCDs与hFIB作用研究

2.2.1 CCDs对hFIB的猝灭机理

hFIB分子中的72个色氨酸残基赋予其很强的内源性荧光，当激发波长为278 nm时，在波长为300～400 nm处能观察到CCDs有很强的荧光发射；而CCDs在激发波长为278 nm时发射的荧光很弱，因此可利用hFIB的内源性荧光变化考察CCDs与hFIB之间的作用规律。CCDs的浓度不同时hFIB的荧光光谱如图6所示。从图中可以看出，当激发波长为278 nm时，hFIB在波长338 nm处有最大发射峰，而CCDs在这种情况下的荧光很弱(见图5)，不会对体系荧光强度的测量产生影响。随着CCDs浓度增加，hFIB的最大荧光发射峰由波长338 nm蓝移至335 nm，并伴随着荧光强度的逐渐减弱，说明在CCDs的影响下，hFIB表面氨基酸残基疏水性能减弱，原因可能是其与CCDs的结合引起本身构象发生变化。

曲线1—12对应CCDs的浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。图6 阳离子碳点(CCDs)对人体纤维原蛋白的荧光猝灭光谱

为了进一步研究CCDs对hFIB的荧光猝灭作用机理，对测定数据采用Stern-Volmer动力学方程进行分析，即

(1)

式中：F0为未加CCDs时hFIB的荧光强度；F为加入CCDs后hFIB的荧光强度；c为CCDs的浓度；KSV为Stern-Volmer猝灭常数。

不同浓度的CCDs与 hFIB作用的Stern-Volmer动力学关系见图7。由图可知： 在热力学温度分别为297、304、310 K，CCDs的浓度为0～2.0 μmol/L时，F0/F与CCDs浓度呈良好的线性关系，且随着温度升高,KSV逐渐减小，说明CCDs对hFIB的荧光猝灭作用不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭，而是生成CCDs与hFIB复合物的静态猝灭[16]；当CCDs的浓度大于2.0 μmol/L时，Stern-Volmer方程的斜率增大，表明CCDs与hFIB中的色氨酸残基作用增强，原因可能是hFIB有72个色氨酸残基，其构象的改变(圆二色结果可证明)会导致包埋的色氨酸残基裸露出来，增加与外源性物质作用的机会。

F0—未加CCDs时hFIB的荧光强度； F—加入CCDs后hFIB的荧光强度。图7 不同浓度的阳离子碳点(CCDs)与人体纤维原蛋白作用的Stern-Volmer动力学关系

利用修正的Stern-Volmer方程可以考察浓度为0～2.0 μmol/L时CCDs与hFIB的结合常数Ka，

(2)

式中fa为荧光接近分数。

CCDs与hFIB的结合常数Ka计算结果见表1。在CCDs的浓度为0～2.0 μmol/L的线性范围内，CCDs与hFIB的结合常数Ka与KSV变化趋势相同：当温度升高时，结合常数Ka减小，说明升高温度会使CCDs与hFIB形成复合物(CCDs-hFIB)稳定性降低，物质间作用的强度减弱，符合静态猝灭的特点。

2.2.2 CCDs与hFIB的结合作用力

小分子和生物大分子间的作用力通常包括范德华力、氢键、静电作用力和疏水作用力等，具体作用力的类型可根据两者相互作用的热力学数据进行判断[17]。本文中通过式(3)—(5)计算CCDs与hFIB作用的热力学参数，结果如表1所示。

表1 不同温度时阳离子碳点(CCDs)与人体纤维原蛋白(hFIB)相互作用的猝灭常数KSV及相应的热力学参数

(3)

ΔG=-RTlnKa,

(4)

(5)

式中：ΔG为吉布斯自由能变，kJ/mol；ΔH为焓变, kJ/mol；ΔS为熵变, J/(mol·K)；T为反应温度，K；R为气体摩尔常数。通过lnKa对1/T作图，可以得到一条直线，由直线的斜率可以计算出ΔH，由直线的截距可以求出ΔS。

由表1可以看出：CCDs与hFIB结合时ΔG<0，说明CCDs与hFIB的结合作用是自发进行的；由ΔH<0、ΔS>0可知，CCDs与hFIB结合时的作用力主要是静电作用力，验证了2.1节中CCDs与hFIB以静电结合的推测。

2.2.3 CCDs对hFIB构象的影响

蛋白质二级结构的变化会引起蛋白质动力学的变化，甚至会导致蛋白质分子活性的改变和丧失。CCDs对hFIB二级结构的影响可以通过圆二色光谱和同步荧光光谱进行考察[18]。

2.2.3.1 圆二色光谱

圆二色光谱是研究蛋白质构象的常用方法之一。图8所示为CCDs与hFIB作用的圆二色光谱。从图中可以看出，hFIB在波长为208、222 nm处有2个负峰，表明hFIB具有典型的α-螺旋结构[19]。当加入的CCDs浓度逐渐增大时，hFIB的圆二色光谱椭圆率先减小后增大，但谱线形状基本不变。这一结果说明低浓度CCDs(1.0 μmol/L)能引起hFIB的α-折叠程度增强，α-螺旋度由起始的16.5%增加到36.0%；当CCDs的浓度大于1.0 μmol/L时，又会使得hFIB分子解螺旋，α-螺旋度由起始的16.5%分别减小到6.80%(CCDs的浓度为2.0 μmol/L)、3.10%(CCDs的浓度为3.0 μmol/L)和-2.38%(CCDs的浓度为5.0 μmol/L)，α-螺旋度可参考文献[20]中的方法计算。由此可知，CCDs的浓度增大时对蛋白的构象影响很大，甚至使蛋白的α-螺旋结构丧失，因此为了保证蛋白的生理功能，CCDs应当在较低浓度(<1.0 μmol/L)范围内使用。

曲线1—6对应CCDs的浓度分别为0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 μmol/L。图8 不同浓度的阳离子碳点(CCDs)与人体纤维原蛋白作用的圆二色光谱

2.2.3.2 同步荧光光谱

同步荧光光谱是蛋白构象变化的常用分析方法，能够反映蛋白质分子中酪氨酸(Δλ=15 nm)和色氨酸(Δλ=60 nm)残基的特征信息。CCDs与hFIB作用的同步荧光光谱如图9所示。由图9(a)、(b)可以看出，加入CCDs后，hFIB的酪氨酸发射峰由波长292 nm蓝移至290 nm，色氨酸残基的荧光发射峰从波长279 nm红移到281 nm，说明CCDs与hFIB 结合后，hFIB分子的疏水微环境改变，即酪氨酸残基周围的疏水性增强，色氨酸残基周围的疏水性减弱，使得该蛋白的构象变得较为疏松。同时，hFIB的同步荧光峰强度都呈现逐步减小的趋势，但减小的幅度不同。图9(c)显示，在任意相同浓度下，酪氨酸残基的荧光强度减小幅度显著低于色氨酸残基的，说明CCDs与hFIB的色氨酸残基作用更强，对其影响更大。同步荧光猝灭率RSFQ为

曲线1—12对应CCDs的浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。(a)酪氨酸残基

曲线1—12对应CCDs的浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 μmol/L。(b)色氨酸残基

(c)同步荧光猝灭率图9 不同浓度的阳离子碳点(CCDs)与人体纤维原蛋白(hFIB)作用的同步荧光光谱

(6)

式中FSF0、FSF分别为不存在、存在不同浓度CCDs时血清蛋白的同步荧光强度。

3 结语

本文中利用一步水热法制备了带正电荷的CCDs，利用荧光猝灭、同步荧光和圆二色光谱考察了CCDs与hFIB的相互作用。CCDs对hFIB产生明显的荧光猝灭效应，猝灭机制为静态猝灭，两者之间形成了复合物。通过计算不同温度时CCDs与hFIB作用的结合常数和热力学参数，可以推断两者通过静电作用力结合。圆二色光谱和同步荧光光谱结果表明，CCDs的加入改变了hFIB的二级结构，使其α-螺旋结构含量先增大后减小，说明CCDs浓度大于1.0 μmol/L时会对蛋白产生变性作用，具有一定的血液毒性。本文中的研究结果对CCDs在生物成像及载药性能方面的应用具有参考价值。