张伟 王世银 高莉 徐梦思 王新华 甘尚权

摘要：【目的】明確绵羊脂肪特异蛋白27基因（Fsp27）5'端非编码区（5'-UTR）g.16767527位点和g.16767779-16767780位点突变与其尾脂沉积能力的关联性，为低脂肪绵羊品种选育提供理想的分子标记，提高低脂肪绵羊品种改良选育效率。【方法】以5个不同尾脂沉积能力的绵羊品种为研究对象，包括脂尾型绵羊品种阿勒泰羊，短脂尾型绵羊品种小尾寒羊和湖羊，长瘦尾型绵羊品种中国美利奴细毛羊和萨福克羊，采用PCR-SSCP结合基因测序对绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变情况进行检测，并分析相关突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性。【结果】绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点为C/A突变，在所检测的绵羊群体中均存在3种基因型（CC、CA和AA），但在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的基因型频率存在明显差异：阿勒泰羊群体中以CC基因型为主，基因型频率为0.869;小尾寒羊和湖羊群体中以CA基因型为主，基因型频率分别为0.698和0.628;中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体则以AA基因型为主，基因型频率分别为0.616和0.833。g.16767527位点的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（PHWE<0.01），在萨福克羊群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（PHWE<0.05）。g.16767779-16767780位点为双碱基突变，对应为GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型;在尾脂沉积能力强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中，g.16767779-16767780位点以TC为优势等位基因，对应的等位基因频率分别为0.862、0.954和0.927;在尾脂沉积能力差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以GG等位基因为主，其等位基因频率分别为0.980和0.983。这2个位点的突变均对绵羊Fsp27基因5'-UTR区二级结构产生明显影响。【结论】绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点的C/A突变和g.16767779-16767780位点的GG/TC突变与其尾脂沉积能力密切相关，可作为分子标记应用于低脂肪绵羊品种的辅助选育。

关键词： 绵羊;Fsp27基因;5'-UTR区;碱基突变;尾脂沉积能力;关联性

中图分类号： S826.8                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）07-1511-09

Abstract：【Objective】To investigate the relationship between the g.16767527 site and g.16767779-16767780 sites mutation of fat specific protein 27 gene（Fsp27） 5' non-coding region（5'-UTR） and the tail fat deposition ability of sheep， find ideal molecular markers for low fat sheep breeding， and then improve the breeding efficiency of low fat sheep. 【Method】Here， five sheep breeds which had different fat deposition abilities were chosen， including the Altay sheep， which is a fat tail or nates sheep breed， small tail Han sheep and Hu sheep， which are short fat tail breeds， and Chinese Merino and Suffolk sheep， which are long thin tail breeds， and PCR-SSCP and gene sequencing were applied to detect the mutation in 5'-UTR of Fsp27 gene and investigated the relationship between the mutation sites and tail fat deposition in sheep. 【Result】The results showed that three genotypes（CC， CA and AA） of the C/A mutation at g.16767527 site in 5'-UTR of Fsp27 gene could be detected in all sheep population included in this research， but their genotype frequency were different in sheep breeds with different fat deposition abilities. The CC genotype was the major one in Altay sheep population， its genotype was 0.869; the CA genotype was the major one in Small Tail Han sheep and Hu sheep， the genotype were 0.698 and 0.628 respectively; but in Chinese Merino and Suffolk sheep， the AA was major genotype， the genotype were 0.616 and 0.833 respectively. The genotype distribution of g.16767527 site extremely significantly drifted Hardy-Weinberg equilibrium（PHWE<0.01） in Altay， Small Tail Han sheep and Hu sheep， and it significantly drifted Hardy-Weinberg equilibrium（PHWE<0.05） in Suffolk sheep population. At g.16767779-16767780 site， there were two mutated bases， and showed three different genotypes， GG/GG， GG/TC and TC/TC respectively. The TC was preponderance genotype at g.16767779-16767780 sites in Altay sheep， Small Tail Han sheep and Hu sheep population， which had a good ability to grow tail fat， and the genotype frequencies were 0.862， 0.954 and 0.927 respectively. But in Chinese Merion and Suffolk sheep population， which had poor tail fat deposition ability， the preponderance genotype was GG and genotype frequencies were 0.980 and 0.983 respectively. Further investigation showed that mutation at the two sites all obviously affected the secondary structure of Fsp27 gene  5'-UTR. 【Conclusion】The C/A mutation at g.16767527 site and GG/TC mutation at g.16767779-16767780 site of Fsp27 gene 5'-UTR of sheep are highly correlated with their tail fat deposition ability， and may be good molecular markers that can be used to breed sheep breeds with low fat.

Key words： sheep（Ovis aries）; Fsp27 gene; 5'-UTR region; base mutation; tail fat deposition ability; relevance

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31860298， 31860639）; Open Project of State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production（MYSKLKF201801）

0 引言

【研究意义】高寒地区绵羊利用夏秋季节牧草充足时期在其尾部沉积大量脂肪作为能量储备，至冬季牧草匮乏时则通过分解尾脂为机体提供能量，顺利度过冬季漫长的枯草期（甘尚权等，2013a）。在过去物质匮乏的年代，绵羊尾脂也是农牧民动物脂肪的重要来源，尾脂沉积能力强的绵羊品种也因此更受青睐。在自然选择和人工选择的共同作用下，高寒地区已形成很多尾脂沉积能力较强的绵羊品种（张伟等，2014），我国新疆北部地区大量养殖的阿勒泰羊就是典型代表。由于养殖条件的不断改善，冬季枯草期已不再对高寒地区的绵羊产生明显影响，且随着人们生活水平的提高，高脂肪食物摄入对健康产生的危害已得到广泛关注。在这种背景下，尾脂发达且胴体脂肪含量高的绵羊品种不再受到农牧民和消费者青睐。因此，如何在保持这类绵羊品种优良性状的前提下对其进行改良选育，对提高脂尾型绵羊品种的市场适应性及促进低脂肪健康羊肉生产均具有重要意义。【前人研究进展】脂肪特异蛋白27（Fat specific protein 27，Fsp27）属于CIDE（Cell death-inducing DEF45-like effector）家族成员，定位于脂滴表面和内质网内（Nian et al.，2010），在促进脂肪细胞的脂滴融合过程中发挥重要作用（潘洪彬等，2014，2015）。Fsp27可在脂滴—脂滴接触点（LD contact site，LDCS）上介导小脂滴中的中性脂经LDCS向大脂滴转移，进而形成更大的脂滴，若Fsp27基因被敲除，则无法完成上述过程（Gong et al.，2011）。Nishino等（2008）研究发现，敲除Fsp27基因后，小鼠的白色脂肪水解速率显著升高，脂肪细胞中的大脂滴转变成很多分散均匀的小脂滴。Xu等（2015）研究证实，正常情况下人类肝细胞中的Fsp27基因表达量很低，当其被激活且上调表达时，会促进肝细胞中的脂滴生长，最终导致脂肪肝发生。董维鹏等（2018）研究表明，在3T3-L1细胞中，若Fsp27基因表达量下调，则细胞中的甘油三酯含量显著下降、甘油含量显著上升，同时大脂滴的生成受抑制，细胞中分散有大量小脂滴。Fsp27肽链N端第1～130个氨基酸残基构成的结构域仅在维持其构象中发挥作用，其C-端第131～239个氨基酸残基在介导LDCS的中性脂转移中发挥关键作用（Tamori et al.，2016），而第120～220个氨基酸残基可与甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）相互作用，抑制ATGL的脂肪分解功能，进而引起甘油三酯沉积（Grahn et al.，2014）。此外，Fsp27可特异性抑制激素敏感脂肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）在脂滴表面的定位，进而抑制脂肪水解（李聪等，2014）。Fsp27基因表达水平与动物体内游离脂肪酸的含量密切相关，当脂肪酸水平升高时，Fsp27基因表达量相应上调，脂肪合成速度加快;而脂肪酸水平降低时，Fsp27基因表达量迅速下调，脂肪水解速度加快，从而使体内的脂肪酸保持在适当水平，以满足机体的能量需求（Nian et al.，2010）。Fsp27在生物体内不稳定，其半衰期约1 h，说明其可快速響应体内脂肪酸的变化（Price et al.，2019）。【本研究切入点】Fsp27基因在调控动物的脂肪沉积过程中发挥重要作用。本课题组前期在绵羊Fsp27基因5'端非编码区（5'-UTR）检测到大量的突变位点，但这些突变位点是否与绵羊的尾脂沉积能力相关尚有待进一步探究。【拟解决的关键问题】以5个不同尾脂沉积能力的绵羊品种为研究对象，对Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点和g.16767779-16767780位点突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性进行系统研究，以期为低脂肪绵羊品种选育提供理想的分子标记，提高低脂肪绵羊品种改良选育效率。

1 材料与方法

1. 1 样品采集

200份湖羊（短脂尾型）耳组织采自新疆生产建设兵团农六师鑫宝种羊场，210份萨福克羊（长瘦尾型）耳组织采自新疆奇台农场种羊场，200份中国美利奴细毛羊（长瘦尾型）耳组织采自新疆吉木萨尔县三台镇细毛羊养殖基地，215份阿勒泰羊（脂尾型）耳组织样品和165份小尾寒羊（短脂尾型）基因组样品由新疆农垦科学院甘尚权研究员课题组馈赠，所有耳组织样品均置于-20 ℃冰箱保存备用。

1. 2 DNA提取

不同绵羊品种耳组织样品的基因组DNA均采用动物组织基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行提取，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1. 3 引物设计与合成

检索Ensemble网站（http：//asia.ensembl.org/index.html），获得绵羊Fsp27基因序列，然后与UCSC中（http：//genome.ucsc.edu/）收录的绵羊基因组序列（Oar_v4.0，Nov. 2015）进行比对，截取包含5'-UTR的1000 bp序列设计2对引物，分别扩增Fsp27基因5'-UTR区（包含g.16767527位点和g.16767779-16767780位点），要求扩增片段控制在300 bp左右，以利于后续进行SSCP检测。扩增引物（表1）采用Oligo 6.0进行设计，然后委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 4 不同绵羊品种Fsp27基因突变情况检测及其尾脂沉积能力关联性分析

以不同绵羊品种基因组DNA为模板，选用表1中的引物分别对Fsp27基因5'-UTR区进行PCR扩增，PCR反应体系25.0 ?L：DNA模板（100 ng/mL）1.0 ?L，10×PCR Buffer 2.5 ?L，dNTPs（10 mmol/L）2.0 ?L，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 ?L，Taq DNA聚合酶（2.5 U/L）0.5 ?L，加ddH2O补足至25.0 ?L。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，参照甘尚权等（2013b）的方法对其进行SSCP检测，挑选不同带型的PCR扩增产物进行测序，以确定其对应的突变位点，并分析相关突变与绵羊品种尾脂沉积能力的关联性。

1. 5 统计分析

采用SPSS 19.0计算不同绵羊群体中Fsp27基因2个SNPs位点的基因型频率及等位基因频率，以卡方（χ2）检验分析各群体中的基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡状态（张伟等，2016）;使用RNAstructure 5.6分析不同位点突变对Fsp27基因5'-UTR二级结构的影响，并通过能值△G变化比较不同构象的稳定性。

2 结果与分析

2. 1 绵羊Fsp27基因5'-UTR区的PCR扩增结果

PCR扩增绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点和g.16767779-16767780位点所在区域，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测均获得清晰明亮的单一条带（图1），未见明显杂带，且扩增片段大小与预期结果相符，说明PCR扩增体系具有良好的特异性和较高的扩增效率，为后续进行SSCP检测提供了可靠保障。

2. 2 绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性

使用Fsp27P1U和Fsp27P1L引物分别扩增不同尾脂沉积能力绵羊品种的基因组，PCR扩增产物经SSCP检测，共获得3种带型（图2-A）;对不同带型对应的PCR扩增产物进行测序分析，可确认其分别为CC、CA和AA基因型（图2-B），说明g.16767527位点在所检测的绵羊群体中均存在3种基因型。

在5个不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中均能检测到绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点，但其基因型频率存在明显差异（表2），且与尾脂沉积能力具有明显的关联性。在脂尾型的阿勒泰羊群体中，CC基因型频率为0.869，CA和AA基因型频率分别为0.094和0.038;在短脂尾型的小尾寒羊和湖羊群体中以CA基因型为主，基因型频率分别为0.698和0.628;在长瘦尾型的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以AA基因型为主，基因型频率分别为0.616和0.833。卡方检验结果显示，g.16767527C>A位點的基因型分布在阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（PHWE<0.01），在萨福克羊群体中显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（PHWE<0.05）。

2. 3 绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767779-16767780位点突变与绵羊尾脂沉积能力的关联性

使用Fsp27P2U和Fsp27P2L引物分别扩增不同尾脂沉积能力绵羊品种的基因组，对PCR扩增产物进行SSCP检测，也获得3种带型（图3-A）;对不同带型对应的PCR扩增产物进行测序分析，发现该位点为双碱基突变，分别对应为GG/GG、GG/TC和TC/TC基因型（图3-B）。此外，在检测绵羊群体中该双碱基突变存在明显的连锁遗传，即G等位基因和G等位基因存在连锁，T等位基因和C等位基因存在连锁。

进一步分析g.16767779-16767780位点在不同尾脂沉积能力绵羊品种群体中的分布情况，结果表明该位点与绵羊的尾脂沉积能力存在明显关联性（表3）。在尾脂沉积能力强的阿勒泰羊、小尾寒羊和湖羊群体中，g.16767779-16767780位点以TC为优势等位基因，对应的等位基因频率分别为0.862、0.954和0.927;在尾脂沉积能力差的中国美利奴细毛羊和萨福克羊群体中则以GG等位基因为主，其等位基因频率分别为0.980和0.983。

2. 4 位点突变对绵羊Fsp27基因5'-UTR二级结构的影响

为进一步了解g.16767527位点和g.16767779-16767780位点突变对绵羊Fsp27基因5'-UTR二级结构的影响，采用RNAstructure 5.6对不同基因型的5'-UTR二级结构进行预测，取自由能最低的预测结果进行比较，结果（图4和图5）发现这2个SNPs位点的突变均对绵羊Fsp27基因5'-UTR二级结构产生明显影响。由于绵羊Fsp27基因的5'-UTR与翻译起始调控、稳定性、剪切加工及细胞内的运输和定位等过程密切相关，若碱基突变造成其二级结构改变，则可能对上述过程产生影响，致使细胞中Fsp27基因的编码蛋白水平发生变化，进而影响其参与调控的生物学过程。

3 讨论

Fsp27定位于脂肪细胞的脂滴表面和内质网内（Nian et al.，2010;许祥等，2020），其对脂肪沉积的调控过程已基本阐明，主要通过以下途径促进脂肪沉积：（1）通过LDCS介导小脂滴中的中性脂肪向大脂滴转移，进而形成一个更大的脂滴（Gong et al.，2011）;（2）Fsp27可特异性抑制HSL在脂滴表面的定位，HSL是脂肪水解过程中的关键水解酶，若HSL无法结合到脂滴上，则无法参与脂肪水解，进而导致脂肪水解受到影响（李聪等，2014）。Fsp27基因在细胞中的表达量与脂肪酸含量密切相关，但Fsp27不稳定，在生物体内的半衰期约1 h，因此其蛋白水平可快速响应细胞内脂肪酸含量的变化（Price et al.，2019）。当脂肪酸水平升高时，Fsp27基因表达量上调，脂肪水解被抑制;而脂肪酸不足时，Fsp27基因表达量下调，脂肪水解速率加快，促使机体的脂肪酸水平和能量供应保持在动态平衡状态（Nian et al.，2010）。可见，脂肪细胞中Fsp27基因的表达量对其生物学功能正常发挥至关重要。

在细胞质中，单链mRNA均通过链内碱基配对而折叠成具有颈环结构的二级结构，而这种结构特点通常是核糖体结合及核酸内切酶识别等生物学过程的重要特征（王琛，2015;李瑞芳等，2018;常卫东等，2019）。由于mRNA的5'-UTR与翻译起始调控、稳定性、剪切加工及细胞内的运输和定位等过程密切相关（邢光东等，2008;高飞，2012），若5'-UTR发生碱基突变而影响其二级结构，势必对其参与调控的信号通路产生影响，进而影响所调控的相关性状。虽然至今未见绵羊Fsp27基因5'-UTR区碱基突变对其生物学功能产生影响的相关报道，但Curi等（2009）对瘤牛及其与黄牛杂交后代的研究结果表明，钙调蛋白抑制蛋白（Calpastatin，CAST）基因5'-UTR区的Ddel多态位点与牛肉的剪切值（SF）及肌原纤维断裂指数（MFI）相关;秦立红等（2010）也研究表明，公牛雄激素受体基因5'-UTR区的T/G突变与其精子密度显著相关;邹辉等（2019）在努比亚山羊骨形态发生蛋白受体-IB（BMPR-IB）基因5'-UTR区检测到A/G突变，其关联分析结果表明该突变位点与努比亚山羊繁殖性能相关，表现为GG基因型母羊的产羔数和子代平均初生重较AA基因型母羊均有所减少。本研究通过对不同尾脂沉积能力绵羊品种Fsp27基因5'-UTR区的碱基突变进行系统分析，结果发现g.16767527位点的C/A突变和g.16767779-16767780位點的GG/TC突变均与绵羊尾脂沉积能力密切相关，具体表现为g.16767527位点为C等位基因和g.16767779-16767780位点为TC等位基因的绵羊品种尾脂沉积能力均明显增强。此外，g.16767527位点和g.16767779-16767780位点的突变均对绵羊Fsp27基因5'-UTR区二级结构产生明显影响，且由于这2个突变位点与绵羊尾脂沉积能力密切相关，故推测这种二级结构的改变可能对mRNA稳定性、转运和翻译效率产生影响，进而影响脂肪细胞中Fsp27基因的表达水平，最终造成绵羊尾脂沉积能力差异。鉴于此，今后应对不同基因型绵羊个体尾脂组织中的Fsp27基因表达水平进行定量分析，进一步揭示这2个突变位点的生物学功能。

脂肪代谢关系到机体能量供应，且一定是通过复杂的调控网络进行精确控制，绝非1～2个基因或SNP位点就能阐述清楚。不同绵羊品种的尾脂沉积能力差异非常明显，为研究脂肪代谢调控机制提供了很好的素材。本研究选用的阿勒泰羊属于脂尾（脂臀）型绵羊品种（赵倩君等，2010），沉积尾部脂肪能力非常强，其尾脂重量可达十几公斤;湖羊和小尾寒羊属于短脂尾型绵羊品种，其尾脂沉积能力相对较弱（巩元芳等，2002;王凯等，2013）;萨福克羊和细毛羊则属于长瘦尾绵羊品种，其尾脂沉积能力最差。此外，这5个绵羊品种地域间隔较远，进行基因交流的可能性较小。本课题组前期曾对阿勒泰羊、小尾寒羊、湖羊、萨福克羊和中国美利奴细毛羊等5个绵羊品种的脂肪沉积相关基因突变情况进行系统研究，发现了大量与尾脂沉积能力相关的SNPs位点（甘尚权等，2013b;王世银等，2013;张伟等，2013），综合本研究的相关数据，后期将对这些数据进行深度分析，进而为低脂肪绵羊品种选育提供理想的分子标记。

4 结论

绵羊Fsp27基因5'-UTR区g.16767527位点的C/A突变和g.16767779-16767780位点的GG/TC突变与其尾脂沉积能力密切相关，可作为分子标记应用于低脂肪绵羊品种的辅助选育。

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（責任编辑 兰宗宝）