翁 婷 郑 洁 黄才欢 欧仕益

(暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510000)

L-半胱氨酸盐酸盐是一种无色至白色结晶或结晶性粉末，有轻微特殊气味和酸味。对亚硝酸盐具有一定的清除能力[1]，具有抗氧化和防酶促褐变作用，能通过延缓龙眼氧化而保持果实品质[2]。L-半胱氨酸盐酸盐能够减轻愈伤组织的褐变[3]，具有防止或推迟褐变的作用[4-5]。美拉德反应香精制备中，L-半胱氨酸盐酸盐能赋予肉香味并降低产品颜色[6]。

同时，L-半胱氨酸盐酸盐还是面粉改良剂[7]。饼干是常见的烘焙食品之一，其主要成分还原糖和蛋白质(氨基酸)在烘焙过程中发生美拉德反应赋予饼干独特的色、香、味，但同时会伴随一些有害物质的产生，如5-羟甲基糠醛、α-二羰基化合物和晚期糖基化终末产物(AGEs)[8-9]等。5-羟甲基糠醛对人体黏膜、横纹肌和内脏具有刺激和损伤作用，具有基因毒性和遗传毒性，且是衡量食品褐变的指标[10-13]。典型的α-二羰基化合物，如3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG)、乙二醛(GO)、丙酮醛(MGO)是AGEs的主要前体物质[14]。α-二羰基化合物不仅存在于食品中，还在人体中产生，与一些慢性或者老年化疾病有关，如动脉粥样硬化[15]、糖尿病[16]、阿尔茨海默症[17]等疾病。还原性物质能够有效抑制GO、MGO和AGEs的形成[18-19]。课题组[20]36-46[21]前期研究表明，半胱氨酸在生理条件下能与HMF、3-DG、GO、MGO形成加合物并降低细胞毒性。L-半胱氨酸盐酸盐应用在韧性饼干中用来改良其品质[22]，但是否能有效降低以上有害醛类和荧光AGEs还未见报道。

研究拟将不同剂量的L-半胱氨酸盐酸盐添加至面团中，研究其对饼干外观和有害物质HMF、3-DG、GO、MGO、荧光AGEs含量的影响，以期为L-半胱氨酸盐酸盐在烘焙食品中的应用提供有益指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

低筋小麦粉：潍坊风筝面粉有限责任公司；

棕榈油：广州珠烽进出口贸易有限公司；

蔗糖、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵、乙醇、邻苯二胺：分析纯，天津大茂有限公司；

5-羟甲基糠醛：纯度98%，北京百灵威科技有限公司；

乙二醛、丙酮醛：质量分数40%水溶液，北京百灵威科技有限公司；

3-脱氧葡萄糖醛酮：加拿大TRC有限公司。

1.1.2 仪器与设备

pH计：FE22型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

微型旋涡混合仪：XW-80A型，上海沪西分析仪器厂；

高效液相色谱仪：LC-20AT型，日本岛津公司；

色谱柱：ZORBAX SB-Aq型，4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦有限公司；

压面机：WA-BYM-15SFT型，江苏无锡市麦威电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 饼干的制备

(1) 配方：根据Zou等[23]的配方略有修改(见表1)。

(2) 制作步骤：先将氯化钠、蔗糖、碳酸氢铵、碳酸氢钠和半胱氨酸盐酸盐分别溶于水中，再加油混合均匀，然后加入小麦粉制备成面团。L-半胱氨酸盐酸盐的添加量分别为0.0，0.3，0.6，1.0，1.5 g/kg，将面团用压面机辊压3次，制成厚度为3 mm的面皮，再用饼干模具制成长48 mm 和宽36 mm大小的饼干，置于预热30 min后的烤箱中，在190 ℃下分别烘焙10 min和15 min后放置在干燥器中保存。

1.2.2 饼干pH与色度的测定 将1 g烘焙10 min的饼干磨碎，在15 mL水中超声60 min，然后在室温下静置1 h，用pH计测其上清液的pH值，每处理重复3次。

表1 饼干配料

将焙烤10 min的饼干冷却至室温后，使用白度仪检测饼干的L*(亮度)、a*(红色/绿色)和b*(黄色/蓝色)，每处理重复5次。

1.2.3 HMF的测定 将1 g烘焙15 min的饼干磨碎，在20 mL水中涡旋5 min充分混匀，10 000 r/min离心10 min，再加入10 mL水按重复提取一次，收集上清液用0.22 μm滤膜过滤。根据Huang等[24]的程序进行HPLC分析，分离操作在ZORBAX SB-Aq柱上进行，采用5%的甲醇溶液等度洗脱25 min。样品进样体积10 μL，流速0.6 mL/min，柱温40 ℃。HMF在284 nm 处检测的标准曲线的回归方程为Y=106 862X+1 767 141(R2=0.997，线性范围10～600 μg/mL)。每处理重复3次。

1.2.4 GO、MGO、3-DG的检测 采用衍生法(形成喹喔啉衍生物)、HPLC检测。将1 g烘焙15 min的饼干磨碎，在20 mL水中涡旋5 min充分混匀，10 000 r/min离心10 min，再加入10 mL水重复提取一次。取1 mL上清液与100 μL 邻苯二胺溶液(1.08 g OPD溶于10 mL甲醇中)涡旋1 min混合均匀，置于60 ℃ 的水浴锅中避光衍生24 h，将衍生完的溶液通过0.22 μm 滤膜过滤，根据Ou等[25]的方法稍作修改进行HPLC分析，样品分离在ZORBAX SB-Aq柱上进行，流动相A为0.1%乙酸—水，流动相B为甲醇，梯度洗脱，梯度程序设置：B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。进样量50 μL，流速1 mL/min，柱温40 ℃。在314 nm处对GO、MGO和3-DG进行定量检测，分别绘制GO、MGO和3-DG的标准曲线进行定量，其中GO的浓度设置为0.01，0.10，0.20，0.30，0.40 μmol/mL，MGO浓度为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/mL，3-DG浓度为10，20，40，60，80，100 μg/mL，得到GO、MGO和3-DG的标准曲线回归方程如下：GO为Y=13 061 332X+47 122(R2=1.000，线性范围0.01～0.40 μmol/mL)；MGO为Y=9 535 572X+22 714(R2=1.000，线性范围0.1～1.0 μmol/mL)；3-DG为Y=96 487X-45 331(R2=0.998，线性范围10～100 μg/mL)。每处理重复3次。

1.2.5 荧光AGEs的测定 将1 g烘焙10 min的饼干磨碎，在5 mL水中超声20 min，10 000 r/min离心20 min，收集上清液。沉淀用2 mL水再提取两次，合并上清液后用0.45 μm滤膜过滤，用水定容至10 mL。将上清液注入96孔黑色平板，每孔100 μL。参照Sadowska-Bartosz等[26]的方法，分别在325/440，330/415，365/480，325/434 nm(激发波长/发射波长)下检测荧光AGEs、二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸。每处理重复9次。

1.3 数据处理

每次处理重复3次以上，运用SPSS进行显著性分析，使用单因素方差分析(ANOVA)中Duncan进行检验(P<0.05)，使用Excel进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 L-半胱氨酸盐酸盐对饼干pH与色度的影响

由图1可知，饼干的pH随L-半胱氨酸盐酸盐添加量的增加呈下降趋势，pH值从9.7下降至9.3，说明添加剂呈酸性能中和一部分面团中的碱。虽然饼干的pH值随L-半胱氨酸盐酸盐的添加有小幅降低，但数值依然在偏碱性范围内。

褐变是饼干在烘焙时的主要变化之一，不仅影响产品外观，还影响口感风味。研究[27]发现，L-半胱氨酸盐酸盐的添加会使酥性饼干品质变好。由图2可知，饼干的L*值随L-半胱氨酸盐酸盐添加量的增加而增加，而a*值和b*值随添加量的增加而下降。说明L-半胱氨酸盐酸盐的增加使饼干红度和黄度下降，白度增加，即饼干在烘焙时呈更亮的颜色。L-半胱氨酸能与褐变产生的醌类反应生成无色化合物[28]，所以添加L-半胱氨酸盐酸盐可以在一定程度上改善饼干的色泽。

2.2 L-半胱氨酸盐酸盐对HMF的影响

HMF是烘焙产品经热加工产生的主要有害物质之一，常常用作焙烤食品的质量指标。模拟生理条件下，L-半胱氨酸可与HMF生成加合物从而消除HMF并降低HMF带来的毒性[20]39-46。由图3可知，L-半胱氨酸盐酸盐可降低饼干中HMF含量，当添加量达0.3 g/kg后，HMF显著下降，降低幅度达84.7%(P<0.05)。继续增加L-半胱氨酸盐酸盐的添加量，HMF降低缓慢，当添加量达1.5 g/kg后，HMF下降94.3%。在组成蛋白质的氨基酸中，L-半胱氨酸除了有氨基外还有一个巯基，更易与HMF发生Michael加成反应[29]。所以添加L-半胱氨酸盐酸盐可显著降低饼干中的HMF含量。

小写字母不同代表样品间存在显著性差异(P<0.05)

小写字母不同代表样品间存在显著性差异(P<0.05)

2.3 L-半胱氨酸盐酸盐对GO、MGO、3-DG的影响

二羰基化合物GO、MGO、3-DG等化学性质非常活泼，可与蛋白质反应形成AGEs、丙烯酰胺、甲基咪唑等，危害人体健康，是热加工食品中需要控制的有害物质[30]。

由表2可知，饼干中会产生较多的3-DG和MGO，而L-半胱氨酸盐酸盐的添加可显著减少饼干中3-DG、GO和MGO的含量，并存在剂量依赖关系。当L-半胱氨酸盐酸盐的添加量为0.3 g/kg时，GO和MGO含量显著下降，分别减少了82.0%和72.1%(P<0.05)，3-DG含量下降了13.7%。添加量增加至1.5 g/kg时，GO和MGO含量分别下降了89.6%和85.0%，3-DG含量虽然只下降了69%，但总量下降了704.2 mg/kg，说明L-半胱氨酸盐酸盐能有效清除饼干中GO、MGO和3-DG。

小写字母不同代表样品间存在显著性差异(P<0.05)

表2 L-半胱氨酸盐酸盐对饼干中3-DG、GO、MGO的影响†

推测L-半胱氨酸盐酸盐降低二羰基化合物含量有两种机制：① 美拉德反应初期，半胱氨酸与Amadori产物反应，阻止了Amadori产物的分子重排，抑制美拉德反应，从而减少了二羰基化合物的产生[31]；② GO、MGO和3-DG等二羰基化合物形成后，半胱氨酸可与其形成加合物，从而降低其含量[21]。

2.4 L-半胱氨酸盐酸盐对荧光AGEs的影响

食品在高温加工过程中，二羰基化合物会与蛋白质上的一些氨基酸残基如赖氨酸、精氨酸反应形成AGEs，包括荧光和非荧光AGEs。荧光AGEs主要有乙二醛赖氨酸二聚体、丙酮醛赖氨酸二聚体、戊糖素、FFI、fluorolink、vesperlysineA-C等，非荧光AGEs主要有羧甲基赖氨酸、羧乙基赖氨酸等[32]。其中荧光AGEs常用于评价热加工食品AGEs形成水平的指标[33-34]。食品中的蛋白质也会发生氧化，产生有害物质并降低蛋白质的营养价值。氧化过程中，蛋白质色氨酸和酪氨酸残基被修饰产生荧光产物，主要有二酪氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸，其可作为蛋白质氧化指标[26]。因此，采用荧光法研究L-半胱氨酸盐酸盐对饼干中AGEs和蛋白质氧化的影响。

由图4可知，随着L-半胱氨酸盐酸盐添加量的增加，AGEs、二酪氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸的荧光值均显著下降，且呈明显的量效关系。当L-半胱氨酸盐酸盐的添加量为0.3，0.6，1.0，1.5 g/kg时，荧光AGEs分别减少了8.9%，18.1%，25.5%，38.1%(P<0.05)。其作用机制可能是L-半胱氨酸盐酸盐抑制了AGEs的前体二羰基化合物的产生。L-半胱氨酸盐酸盐对蛋白质氧化的抑制作用强于对荧光AGEs的抑制作用，当添加量为1.5 g/kg时，二酪氨酸、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸分别减少了53.0%，45.5%，51.4%(P<0.05)，接近甚至超过了半抑制率。其原因可能是L-半胱氨酸盐酸盐具有抗氧化活性，从而抑制了蛋白质中氨基酸的氧化。

3 结论

L-半胱氨酸盐酸盐在改善饼干外观的同时，还显著抑制饼干中活泼羰基化合物(HMF、3-DG、GO、MGO)和荧光AGEs形成，同时抑制蛋白质的氧化，且呈剂量效应，说明L-半胱氨酸盐酸盐可应用于饼干制作中来控制其主要内源性化学污染物的产生。试验也证实了活泼羰基化合物与L-半胱氨酸可形成加合物从而抑制AGEs的形成，且L-半胱氨酸盐酸盐对内源性污染物具有高效的清除能力[21]。后续可进一步探讨L-半胱氨酸盐酸盐的作用机理以及其对焙烤食品风味形成的影响，为L-半胱氨酸盐酸盐在焙烤食品中的应用提供更多的科学依据。

小写字母不同代表样品间存在显著性差异(P<0.05)