病理免疫组织化学抗原修复技术的研究

2020-11-06崔锦珠文亦磊覃绍勇陈玲

中国医学创新 2020年24期

崔锦珠文亦磊覃绍勇陈玲

【摘要】 20世纪70年代免疫组织化学技术开始应用于病理诊断，发展到今天，免疫组织化学检测在临床病理诊断中已成为重要的技术手段，尤其在疑难病例的病理诊断和鉴别诊断工作中发挥着极为重要的作用。但为了确保免疫组化技术操作结果的准确性，必须实行可靠的质量控制和标准化的操作。全自动免疫组织化学染色机的使用有利于规范化操作，使流程更加标准化，解决了部分问题，但在抗原修复环节仍有许多不同意见，该文就免疫组化技术操作环节中的抗原修复标准化进行综述。

【关键词】免疫组织化学病理诊断质量控制

[Abstract] In the 1970s， immunohistochemistry technology began to be used in pathological diagnosis. Today， immunohistochemistry detection has become an important technical means in clinical pathological diagnosis， especially in the pathological diagnosis and differential diagnosis of difficult cases. However， in order to ensure the accuracy of immunohistochemistry results， reliable quality control and standardized operation must be carried out. The use of automatic immunohistochemical staining machine is beneficial to standardize the operation， make the process more standardized， and solve some problems. However， there are still many different opinions in the antigen repair process. This paper summarized the standardization of antigen repair in the operation process of immunohistochemistry technology as follows.

[Key words] Immunohistochemistry Pathological diagnosis Quality control

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530023， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.24.041

醫疗卫生技术不断进步，免疫组化技术也飞速发展，当今，在临床病理诊断中免疫组化技术的大量运用，显著提高了我国的病理诊断水平，免疫组化技术的地位也越来越高[1]。在肿瘤个性化治疗的今天，依靠免疫组化技术进行精确诊断在日常病理诊断工作中占着非常大的比重，如雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人类表皮生长因子受体-2（HER2）的表达可为乳腺癌治疗方案的选择提供依据;CD117（+）的胃肠道间质瘤可选用格列宁药物进行治疗等。高质量、稳定、可重复性是免疫组织化学技术操作的关键，这就涉及一个名词-标准化。首先提出免疫组化标准化这一概念的机构是美国的国家临床实验标准委员会（national committee for clinical laboratory standards，NCCLS），它在1999年将这一标准统一到全球，发布了参考文件。免疫组化标准化概念的主题思想主要是：标准化的免疫组化染色技术（采用良好的组织前处理;良好的抗原修复技术，使抗原充分暴露;可靠稳定的标准化实验操作过程）;实验对照的正确设立;染色结果的正确判读;标准化的免疫组化检测报告[2]。近些年许多病理学者也对其进行了讨论和补充。现在大量全自动免疫组织化学染色机的使用有利于规范化操作，使流程更加标准化，解决了免疫组化染色技术的部分问题。但在抗原修复技术方面仍有很多不同意见，需要不断完善、规范日常的技术流程。

1 概述

免疫组化的大多数标本是用4%中性甲醛固定，甲醛固定的标本会导致蛋白之间的交联及抗原决定簇被封闭。自从Shi等[3]在1991年提出抗原热修复方法后，大家知道通过不同的抗原修复方法，可暴露抗原决定簇，使抗原抗体结合。但不恰当的修复方法可造成内源性生物素的表达，导致假阳性结果[4];或可造成抗原修复不成功，抗原暴露不充分，染色结果出现假阴性。只有掌握抗原最佳的修复方法才能提高免疫组织化学结果的阳性率与准确率。

2 具体因素

修复所涉及的因素主要有修复的方法、修复液的选择、修复的时间等。目前各国实验室主要采用蛋白酶消化法和热处理方法来对抗原进行修复。热处理方法又有微波加热修复法、高压加热法和水浴法。而抗原修复液分为EDTA修复液（pH值8.0～9.0）、柠檬酸盐修复液（pH值6.0）、Tris修复液（pH值10.0）等。各实验室目前不仅采用不同的修复方法、不同的修复液，修复的时间也不尽相同。

2.1 修复的方法根据相关报道，包含英国、澳大利亚、加拿大等大国在内的8个英联邦国家组织了106家实验室进行一项研究，总共花费接近3年的时间来对ER、PR进行反馈实验。得出了一致结论：ER、PR染色弱的原因主要与实验中微波加热时间不足和微波操作过程不当有关，因此免疫组化修复应使用高温高压修复方法[2]。

华裔实验人员也通过收集上百份乳腺浸润性导管癌标本论证该修复方法[5]。实验人员对这些标本进行ER、PR、E-Cadherin、C-erbB-2四项免疫组织化学标记，使用显微镜观察判断这些标本的阳性率和阳性程度，证实了高温高压抗原修复法在标本的显色强度和背景清晰度方面均高于传统的微波修复法。

也有学者分析了修复液、时间、pH值都相同的条件下，微波抗原修复法修复效果低的原因可能是：微波炉修复温度不好控制，稳定性差，切片就会出现一些非特异性染色。高压修复则能很好地控制温度，在120 ℃左右，能彻底消灭标本内的生物酶活性，有效阻断非特异性着色[6]。

郑秋桦等[7]也采用了控制变量法，使用改良Tris-EDTA（pH值9.0）修复液，通过微波、水煮和高压几种不同修复方法对P53、P63、Ki67、CK5/6、CK7几个不同抗体进行免疫效果实验，发现高压修复方法的效果最好。何丹等[8]在食管癌标本用高压抗原修复法和微波抗原修复法两种方案进行CD4、CD8、IL17、Ki67等免疫组化染色实验，最终实验结果：CD4抗体表达实验高压修复效果优于微波修复效果（P<0.05），其他三项指标比较差异均无统计学意义（P>0.05），同时也提出高压修复相对剧烈，容易引起掉片现象，应该引起注意。

在实验室免疫组化检测中，脑组织标本会出现掉片和背景染色等现象，会给明确诊断带来严重影响。脑组织的构成元素主要为胶质细胞，通过神经元连接而成，脑组织细胞中水分和脂质含量较高，在修复过程中会发生掉片。针对这一现象，陈余朋等[9]认为可以将切片架外围包裹一层纱布，纱布可以有效地将沸腾的修复液与组织隔离，防止沸腾冲击导致的组织掉片和破损，在热孵育法也可如此操作。

在病理诊断中淋巴瘤分类有百余种，单借助HE染色结果很难有效进行诊断和鉴别诊断。最新NCCN指南要求，淋巴瘤诊断必须以形态学为基础，结合免疫组化方能确诊。实验组人员虞飞等[10]运用了各种修复手法，包括Tris-EDTA高压修复法、Tris-EDTA煮沸修复法、柠檬酸高压修复法、柠檬酸煮沸修复法、蛋白酶修复法、DAKO全自动染色机、LUMATAS全自动染色机、VENTANA全自动染色机等8种不同的修复方法对辅助淋巴瘤诊断的抗体CD5、CD10、CD23和Bcl-6进行免疫组化检测，实验结果证实高压修复的免疫组化染色阳性结果强度最高，经蛋白酶修复的免疫组化染色阳性强度最低。Tris（pH值9.0）高压修复2.2 min能最有效地暴露抗原，是淋巴瘤标本中抗原修复的最佳方法，可为准确诊断淋巴瘤提供帮助。

在高压热修复操作过程中，大家会注意到，单高压热修复也分为直接水煮、隔水加蓋水煮、隔水不加盖水煮等方式。王璐[11]进行不同方式水煮加热EDTA抗原热修复实验后认为，直接水煮抗原修复染色结果最好，隔水加盖抗原修复次之，隔水不加盖抗原修复最差。

在热孵育法中蔡俊杰[12]认为，甲醛固定的组织修复温度必须达到92 ℃才能使抗原充分暴露，温度范围为92～98 ℃，95 ℃时效果最好。

但对于不同抗原，修复所需温度并不都遵守这一规律。邹琼瑜等[13]选取了保存时间超过4年的陈旧乳腺癌患者组织石蜡样本76例。每个样本选择3张切片分别归入试验组、高压组和微波组进行实验。高压组和微波组使用同种加热修复方式处理切片，实验组在酸碱度为（3.5±0.1）的柠檬酸盐修复液中室温修复15 min。对3组切片进行比较，可以看出实验组的染色结果明显优于高压组和微波组，脱片率及折损率也明显低于高压组和微波组。基膜的构建和稳定性主要由层黏连蛋白（laminin，LN）决定，它是基膜的主要构成成分，并且这种糖蛋白在多种组织中都大量存在，使基膜与细胞紧密结合，对细胞的增殖分化有着较大的影响。刘鲜艳等[14]实验人员分别使用高压、胰酶、胃酶和联合修复方式对LN进行修复测试，观察修复方法的优劣，得出胃酶1 h修复方式效果最好，LN染色结果最佳。

有些组织并不需要抗原修复，而有些特殊组织不仅需要多重抗原修复方法联合应用，更需要延长一抗孵育时间，才能得到较好的实验结果。

黄建平等[15]用不同抗原修复法对HBcAg进行免疫组化染色，证实：切片不修复表达效果最好，切片高温高压修复，阳性表达最差。对于这个实验结果，笔者认为乙肝病毒的核壳结构蛋白HBcAg，结构成分不是人体组织，固定时并不被甲醛封闭。加热抗原修复，是修复甲醛固定抗原被封闭的组织，如果抗原未被甲醛固定封闭，高温会使蛋白质抗原发生变性，失去与抗体结合的能力，结果会使表达减弱甚至不表达。大多数抗原一般提倡的热修复法，对于如HBcAg的特殊抗原会起反作用。马秀利等[16]用不同修复方法对大鼠嗅黏膜低亲和力p75NTR进行免疫组化比较时，认为神经营养因子受体是低亲和力受体，暴露其抗原决定簇的条件较高，应当在酶修复（30 min）破坏福尔马林对嗅黏膜上蛋白交联作用后，再使用高温修复使抗原暴露，另外延长一抗孵育时间至72 h可以得到较好的阳性结果。黄利等[17]也探讨了抗原修复是否为单克隆抗体免疫组化染色的必须处理方式，笔者使用全自动免疫化染色机，分别进行p-stat3、Vimentin免疫组化抗原修复、不修复及阴性对照染色并对染色做出评价。从最终实验结果可以明显看出修复后的p-stat3和未修复未见明显差异，而Vimentin免疫组化染色则需进行抗原修复处理。因此得出结论：抗原修复过程非常重要，但需要选择性使用，有些抗体并不需要修复也能达成相同效果。

由这些实验数据可知，相同的修复液，高温高压法相对于热孵育法、微波法、蛋白酶修复法有更好的修复能力。使用高温高压的修复处理方式能提高大多数免疫组化染色效果，使阳性定位准确，色彩鲜明。且切片直接接触抗原修复液的修复方法染色结果最好。但是不存在适合所有抗原的单纯抗原修复方法，要根据抗原的不同采用相应的修复手段，即高温高压修复法也应根据工作需要，合理选择。

2.2 修复液的选择抗原修复液的种类有很多，其中包括柠檬酸盐修复液（pH值6.0）、EDTA修复液（pH值8.0～9.0）、EGTA修复液（pH值9.0）和Tris修复液（pH值10.0）。在抗原加热修复过程中，抗原在不同酸碱度条件下等电点会发生变化，抗原表面电荷的改变影响抗原抗体的结合，从而影响染色强度[18]。

Shi等[3]报道了不同pH值抗原脱蜡修复液对免疫组化抗原热修复的影响，并认为pH值8～9的Tris-HCL或EDTA缓冲液适用于大多数抗原。张丽娜等[19]分别在pH值6.0和pH值9.0酸堿度下，观察并检测PD-L2分子作用于食管鳞状细胞癌组织中的染色情况，得出结论：酸碱度为9.0的抗原修复液作用于食管鳞状细胞癌，免疫组化染色情况最好，能明显提高切片的染色质量，是检测PD-L2分子的最好方法。陈晨等[6]证实EDTA（pH值9.0）修复方式能够提高快速冷冻乳腺癌组织ER、PR、HER2阳性表达率。李丹等[20]也证实相比于EDTA缓冲液，柠檬酸缓冲液的效果更好，能提高弥漫大B细胞淋巴瘤中的Ki67、BCL-2抗体表达。Tris-EDTA（pH值8.0）的修复液更有利于免疫组化染色过程中核抗原的暴露。

江齐昌等[21]则以家兔作为实验对象，对家兔的颈动脉粥样硬化陈旧性蜡块组织进行切片，共切片198张，使用单纯加热方式、单纯胰蛋白酶和联合抗原修复方式观察切片中的染色结果。实验最终得出结论：联合抗原修复方式效果明显优于单纯加热方式或单纯胰蛋白酶抗原修复方式，切片的染色效果更好。

江桂英等[22]在实验中使用了两种不同的抗原修复液，微波加热使用EDTA（pH值8.0）修复液和微波加热使用柠檬酸盐修复液（pH值6.0），结直肠癌组织Ki67、P53、CK20、CerbB-2、Bcl-2免疫组化染色实验的对比结果：微波加热使用EDTA（pH值8.0）修复液对于Ki67、P53、BCL-2修复效果更理想，但对于CK20，两种修复液效果差别不大，微波加热使用柠檬酸盐修复液（pH值6.0）对C-erbB-2修复效果较好，但修复液pH值超过8.0时会影响组织的附着，容易掉片。

综上，大多数抗原更适合高温高压修复方式，而 pH值9.0修复液修复效果优于pH值8.0的修复液。皮肤组织、雌激素受体、淋巴组织等选择EDTA（pH值8.0），染色效果最佳[23]。

2.3 修复过程对免疫组化染色结果的影响通过以上几组实验论证，可以得知在免疫组化修复手段中，高温高压修复方法在大多数情况是最好的方法，但修复时间的把控也非常重要，过长的修复时间可能会导致细胞非特异性着色和组织脱片。

黄建平等[24]探讨了不同修复时间，柠檬酸抗原修复液对免疫组化染色结果的影响，喷气后高压加热2、8及15 min三组切片，染色结果基本一致，27种抗体均表达良好，阳性定位准确，背景清晰。三组切片的阴性对照也均呈阴性，无背景染色。结果证实延长柠檬酸高压修复时间并不会对染色结果造成实质影响，修复时间过长不会暴露更多抗原决定簇，造成染色结果增强，甚至背景染色，也未造成抗原的破坏而减弱抗体表达。

陈芸等[25]收集47例乳腺癌及结直肠癌手术切除标本，并从标本中提取出肿瘤成分制作成结直肠癌及乳腺癌组织的芯片，按说明书建议进行热修复。在修复过程中对芯片采取不同的降温手段，一组使用自然降温手段，自然冷却20 min，另一组修复后立即用流水冲淋高压锅，或在锅内注水急剧降温，降温完成后对芯片进行观察，发现芯片中ER、PR等几组抗体的染色强度没有明显变化，但急速降温组的Ki67表达弱于缓慢降温组。结肠癌组织芯片中CK（CAM5.2）、CK（AE1/AE3）两组染色强度差异不显著，但CDX-2、Villin、MSH2急速降温组的表达强度弱于缓慢降温组。实验表明，相比于急速降温手段，自然降温方法对芯片的修复效果更显著，掉片率更低。因此在降温过程中，最好关闭加热装置，等组织恢复自然温度再进行后续的免疫组织操作。

在临床实践中已经证实免疫组化抗原修复时间对那些假阴性及弱阳性表达的组织有绝对性的影响，适当增加修复时间有利于提高组织切片的阳性结果。所以在免疫组化操作抗原修复环节，抗原修复液的pH值、修复的温度、修复的时间均会影响抗原修复。根据实验表明，温度越高，修复的时间也就越短[5]。

3 展望

免疫组织化学技术是现代医学中一门重要的技术，高质量的免疫组织化学染色结果能辅助病理医师更准确地进行病理诊断，提高病理诊断水平;非特异性的免疫组化染色结果可能会引起漏诊甚至造成错误的病理诊断。所以提高免疫组织化学的制片质量已经是刻不容缓的责任。该技术的操作过程十分复杂，操作过程中的每一个环节都严重影响着切片的质量。而选择合适的免疫组化修复方法及掌握合适的修复液pH值及修复时间至关重要。临床诊断要依据阳性的准确定位、内外对照的结果、组织细胞形态学的观察和丰富经验综合判断免疫组化结果。在工作中认真负责完成每一个环节是医生和技术人员的责任，应不断学习，总结相关的操作经验，将切片操作过程现代化、规范化，并在操作过程中严格遵守实验室的各种规章制度，充分发挥免疫组化技术在病理诊断中的重要作用，为医院的临床治疗提供指导作用。在抗体使用说明书的指导下，结合自身实验室的具体情况，根据抗体种类予以选择修复，要清楚影响抗原的因素及各种抗原修复方法，必要时可以多种方法同时使用。

参考文献

[1]马喆，王洪岩，袁东辉，等.病理免疫组化质量控制过程中应注意的几点[J].诊断病理学杂志，2015，22（3）：187.

[2]王小亚，杨清海，黄奇平.免疫组织化学标准化[J].诊断病理学杂志，2008，15（1）：80-81.

[3] Shi S R，Key M E，Kalra K L.Antigen retrieval in formalin-fixed，paraffin-embedded tissues：an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections[J].J Histochem Cytochem，1991，39（6）：741-748.

[4]周小鸽，王鹏，陆鸣.加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物的影响及其对策[J].中华病理学杂志，2002，31（6）：491-496.

[5]刘智，杨娜，夏勤，等.论述免疫组织化学染色中抗原修复方式及对比分析[J].临床医药实践，2017，26（3）：217-218，232.

[6]陈晨，傅春燕，金中元.抗原修复对乳腺冷冻切片后组织ER、PR、c-erbB-2蛋白表达的影响[J].诊断病理学杂志，2011，18（5）：399.

[7]郑秋桦，李钰湘，柯野，等.3种抗原修复方法对免疫组化染色效果的影响[J].韶关学院学报，2017，38（12）：51-54.

[8]何丹，王杜娟，曾丽华，等.不同抗原修复方法在免疫组化染色中的应用[J].深圳中西医结合杂志，2015，25：（15）：35-36.

[9]陈余朋，胡力文，张声，等.脑组织样本免疫组化过程存在问题与对策[J].诊断病理学杂志，2018，25（10）：728-729.

[10]虞飞，冯立文，项鹏程，等.不同抗原修复方法在淋巴瘤免疫组化检测中的应用[J].诊断病理学杂志，2019，26（9）：622-623.

[11]王璐.不同方式进行的EDTA抗原热修复对免疫组化结果的影响[J].诊断病理学杂志，2017，24（2）：143-144.

[12]蔡俊杰.有关免疫组织化学技术方法若干问题的探讨[J].中国组织化学与细胞化学杂志，1998，7（3）：133-137.

[13]邹琼瑜，叶琼，陈丽雅.不同抗原修复方法在陈旧性石蜡切片乳腺珠蛋白免疫组化中的比较[J].中国微生态学杂志，2016，28（12）：1429-1432.

[14]刘鲜艳，郝斌威，马爱玲，等.不同抗原修复方法对层粘连蛋白免疫组化染色结果的影响[J].临床与实验病理学杂志，2015，31（2）：216-217.

[15]黄建平，杨映红，吴雪晶.不同抗原修复法对免疫组化HBcAg染色结果的影响[J].临床与实验病理学杂志，2017，33（5）：577-578.