张欣磊，邱雅静，王艳红，*，宋垚彬，吴爱平，苏秀

1. 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，杭州 311300

2. 杭州师范大学生态系统保护与恢复杭州市重点实验室，杭州 310036

3. 湖南农业大学生物与科学技术学院，长沙 410128

0 前言

土壤盐碱化是世界性的的生态环境问题之一[1-4]。我国盐渍土总面积约 1×108hm2，主要分布在我国长江沿岸和北方地区，且受人口持续增长、工业污染突出、灌溉农业的大力发展和化肥大量使用等因素的影响，目前土壤次生盐碱化不断扩展[5]。研究表明，土壤盐渍化极大地抑制了植物根、茎、叶等器官的生长和发育[6-7]，导致植物受到损伤甚至死亡从而造成农林业严重减产[8-9]。综合已有的研究，盐害对植物的影响主要体现在三个方面: ①降低土壤溶液的渗透势，减少植物根系对水分的吸收，从而使植物遭受“生理干旱”[3，10]；②过量的 Na+和 Cl-对细胞产生毒害作用，例如，破坏了酶和其他大分子物质的结构、使细胞器和质膜受损，从而使光合作用、呼吸作用和蛋白质合成等主要的代谢过程受阻[10-11]；③植物养分失衡，这是由于离子的选择性吸收导致植物生长必须的养分(如N和P等)和离子的吸收或转运受阻[3，12]。为降低土壤盐度和减少农林业损失，研究者们尝试从物理、化学和工程等不同角度来改良盐渍土和选育抗盐或耐盐的植物品种或通过基因工程改造的方法来培育新的抗盐品种[13]。然而，这些方法在实施过程中，要么容易受到气候、水分条件的严重限制而易造成土壤反盐，要么历时长且投资巨大[3]。通过生物的方法，即应用 AM 真菌(丛枝菌根真菌——Abuscular mycorrhizal fungi，简称 AM 真菌)来降低盐胁迫对植物的生长的抑制作用被认为是最为绿色高效的方法，近些年越来越受到人们重视[12，14-19]。AM真菌是土壤中分布最为广泛的根际微生物类群，与农林业生产关系最为密切，能与陆地上 80%以上的植物根系建立共生关系，形成菌根结构[15]。国内外研究表明，AM 真菌在盐生环境中天然存在，且以球囊霉属(Glomus)为主要优势属，有利于提高植物的耐盐性，促进植物在盐渍条件下的生长和养分吸收[3，12]。然而，关于AM真菌对盐胁迫下白芨生长和养分吸收的影响研究则相对较少。

白芨[Bletilla striata(Thunb.) Reichb. f.]是我国传统的中药材，其地下块根具有清热利湿、收敛止血、消肿生肌等功效，经济价值高[20]。目前对白芨的研究比较有限，主要集中在种质资源、种苗繁育、化学成分分析等方面[21-22]。浙江省具有较大面积的沿海滩涂，如何扩大白芨在盐胁迫生境下的生长是其产业链上一个亟待解决的问题。为此，本实验通过接种 AM 真菌，研究盐胁迫下AM真菌对白芨生长的调控机理，以期为白芨的大面积栽培和产业化管理提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

本实验在浙江省杭州临安区浙江农林大学平山实验基地(119°43′E，30°15′N)进行。临安位于浙江省西北部，为亚热带季风气候，年平均气温为 16.4 ˚C，极端最高气温为 41.9 ˚C，极端最低气温为-9.2˚C，全年日照时数为 1847.3 h，年平均降水量为 1628.6 mm，无霜期为 237 d，土壤为红黄壤[23]。

1.2 供试材料

白芨(B. striata)属多年生草本地生兰科(Orchidaceae)白芨属(BletillaRchb. F)植物，主要分布在贵州、广西、安徽、四川、云南、陕西、甘肃等地，具有很强的适应性、观赏价值、药用价值和经济价值[22]。本实验选用健康且长势一致的无菌培养的1年生白芨幼苗20株作为实验材料。经过标准化处理后，所有白芨幼苗移栽于 18 cm × 11 cm × 10 cm带有盆托的塑料花盆中，栽培基质为当地红黄壤和进口泥炭土按3:1体积比混合均匀后过2 mm土壤筛，121˚C高压湿热灭菌2 h，以消除基质中的真菌孢子和其他土壤微生物，并放置两周后使用。每盆装混合基质 750 g。培养基质养分含量为: 有机质21.94 mg·g-1，全氮 0.80 mg·g-1，全磷 0.32 mg·g-1，pH 5.68(水:土 =5:1)。供试菌种为摩西球囊霉(Glomus mosseae；BGC HUN03B)，由北京市农林科学研究院植物营养与资源研究所提供。

1.3 实验处理

采用二因素完全随机试验设计，设置NaCl盐溶液处理(0 mM和200 mM)两个水平和AM真菌接种处理(不接种和接种摩西球囊霉)两个水平，共计四个处理组合，每个处理组合重复5次，随机排列。其中，AM 真菌接种处理中接种物为经高粱扩繁后制成含有孢子、菌丝及侵染根段的接种物，其用量为每盆 20 g；不接种处理中每盆施加等量的灭菌接种物和不灭菌接种物水滤液100 mL，以保证不同处理间除AM真菌以外的微生物区系保持一致[24]。幼苗生长30 d后开始盐胁迫处理，为避免盐溶液一次性加入对植物造成伤害，将盐溶液分7次加入土壤中，每天每盆添加相应浓度盐溶液50 mL，连续添加7 d，这样7 d后每盆添加的盐溶液总量为350 mL，对照加等量的蒸馏水[25]。常规管理，适时浇水，每次浇水时掌握适量，尽量减少溢出，溢出的盐溶液要重新倒回花盆内，以保证实验期间各处理盐浓度的一致性。实验期间，塑料大棚内平均温度为 28.6 ˚C，平均湿度为65%。

1.4 指标测定

实验处理时间为2016年5月初至2016年10月底。收获时将各处理组植株用蒸馏水洗净，吸干表面水分，测定根长、基径，并将植株分为根、茎和叶不同部分，测量其鲜重。随机选取部分新鲜叶片，测其叶面积。叶面积的测定采用扫描仪(Epson V330，Japan)分别将各个叶片扫描成电子图像后，应用Image-J 软件(1.44p；National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)测其面积[5]。同时，每个处理随机选取若干根样，利用Phillips和Hayman[26]改进的方法染色，采用网格交叉法测定侵染率[27]。最后，将白芨其他部分和剩余根系放入65 ˚C下烘至恒重并称其各部分干重。并测量植物地上、地下两部分的全N和全P含量。植物营养元素N用H2SO4-H2O2凯氏定氮法测定，全P含量用钒钼黄吸光光度法测定[28]。

1.5 数据处理

以白芨的菌根生长效应(MGR)[29]、地下部分(白芨的药用成分在于其地下部分)磷依赖性(MPR)、氮依赖性(MNR)[4]来量化不同盐处理水平下菌根效应，其计算公式如下所示:

对所测指标采用二元方差分析(General Linear Model；GLM 过程，SPSS 23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)研究盐胁迫和AM真菌对白芨各相关指标的影响。数据分析前，根长、叶面积和根干重经平方根转换，基径和根冠比经 lg10转换后符合齐性检验，其他指标不经过转换均符合正态性和齐性检验。同时，采用LSD法检验各个处理组合之间的差异显著性。另外，采用独立性 t检验(SPSS 23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析盐胁迫不同水平对白芨菌根MGR、MPR和MNR的影响。

2 结果与分析

2.1 AM真菌对盐胁迫下白芨根系侵染率的影响

通过对白芨根系菌根侵染率的调查发现，盐胁迫、AM真菌及其两者交互作用均对白芨根系侵染率具有显著或极显著的影响(表1)。与对照盐浓度相比，高盐浓度下，AM真菌接种植株(简称AM植株；下同)的根系侵染率显著下降了约 44.1%，说明高盐胁迫对 AM真菌的生长具有显著的抑制作用；不论是在对照或高盐条件下，与未接种AM真菌的植株(简称 NM 植株；下同)(平均侵染率为4.11%)相比，AM 植株的根系侵染率均显著提高(图 1)。

2.2 AM真菌对盐胁迫下白芨生长和养分吸收的影响

通过二元方差分析表明，盐胁迫对白芨的根长、基径、根干重和总干重均具有显著或极显著的影响；AM真菌根干重和总干重具有显著影响；两者的交互仅对总干重有显著影响(表 1)。进一步地，通过对总干重的分析发现，接种 AM真菌显著提高了白芨的总干重，尤其是在对照盐浓度下，与 NM 植株相比，AM 植株的总干重显著增加了约 56.1%；然而，随着盐浓度增加，白芨总干重下降，在高盐浓度下，AM 植株的总干重虽然高于NM植株，但两者差异并不显著，说明 AM真菌的促进作用受到盐胁迫的抑制(图 2A)。盐处理及其 AM真菌处理对白芨根冠比的作用并不明显，说明其对白芨的生物量分配没有明显作用(图2B)。

表1 白芨幼苗的相应参数对盐胁迫、AM真菌及其两者交互效应的二元方差分析的F值及其自由度Table 1 F values of Two-way ANOVA for the effects of salt stress, arbuscular mycorrhizal fungi and their interactive effects on the parameters of Bletilla striata seedlings

图1 盐胁迫下AM真菌对白芨幼苗根系侵染率的影响Figure 1 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)on root colonization of Bletilla striata under salt stress

图2 盐胁迫下AM真菌对白芨幼苗总干重(A)和根冠比(B)的影响Figure 2 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)on total dry weight (A) and root /shoot ratio (B) of Bletilla striata under salt stress

通过对地上和地下部分氮磷含量的研究发现，盐胁迫对地上和地下部分的氮磷含量均有极显著的影响；AM 真菌对地上部分氮含量和地下部分氮含量有显著或极显著的影响；两者的交互作用对地上部分磷含量和地下部分的氮磷含量均有显著或极显著的影响(表 1)。随着盐浓度增加，白芨地上部分的氮含量显著增加；另外，在对照盐浓度和高盐浓度下AM植株的地上部分氮含量比NM植株分别显著增加了约10.8%和12.1%(图3A)。类似地，随着盐浓度增加，地下部分的氮含量显著增加；在对照盐浓度下，AM植株与NM植株的地下部分氮含量没有显著差异而在高盐浓度下，AM植株的地下部分氮含量比NM植株显著降低了约9.8%(图3B)。随着盐浓度增加，地上部分磷含量显著下降；对照盐浓度下，AM 植株的地上部分磷含量比NM植株显著增加了约8%而在高盐浓度下，AM植株的地上部分磷含量与NM植株差异不显著，说明在高盐下AM真菌对地上部分磷含量的促进作用受到抑制(图3C)。随着盐浓度增加，白芨地下部分磷含量显著增加，尤其AM植株的地下部分磷含量在高盐下比在对照盐浓度下显著增加了约20%；在对照盐浓度下，AM 植株的地下部分磷含量比NM植株显著降低了约10%而在高盐浓度下，AM植株则比NM植株显著增加了约11%(图3D)。

进一步地，通过对白芨总干重与各测量指标的相关回归分析发现，白芨总干重与地上部分磷含量显著负相关而与地下部分氮含量显著正相关(图4)。此外，通过对 AM 菌根效应的分析发现，随着盐浓度的升高，白芨的菌根生长效应(MGR)虽然下降但盐处理的效应并不显著(t4= 1.966，P= 0.121)；白芨的氮依赖性(MNR)显著下降了约8倍多(t4= 3.708，P= 0.021)而磷依赖性(MPR)则显著上升了约2倍多(t4= 14.119，P= 0.000) (图 5)。

图3 盐胁迫下AM真菌对白芨幼苗地上部分氮含量(A)、地下部分氮含量(B)、地上部分磷含量(C)和地下部分磷含量(D)的影响Figure 3 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on N concentration of shoot (A), N concentration of root (B), P concentration of shoot (C) and P concentration of root (D) of Bletilla striata under salt stress

图4 盐胁迫和AM真菌作用下白芨幼苗总干重与地上部分磷含量(A)和地下部分氮含量(B)的关系Figure 4 Relationship between total dry weight and P concentration of shoot (A) and N concentration of root (B) of Bletilla striata under salt stress and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)

图5 不同盐胁迫水平下接种AM真菌对白芨幼苗菌根效应的影响Figure 5 Effects of AMF on the mycorrhizal growth response (MGR), mycorrhizal P response (MPR) and mycorrhizal N response (MNR) of Bletilla striata under salt stress

3 讨论

3.1 AM真菌对盐胁迫下白芨生长和养分吸收的影响

本实验中盐处理对白芨的侵染率和总干重生长具有显著的负效应(图1和图2)，这与以往盐处理对胡椒(Capsicum annuumL.)[30]，羊草(Leymus chinensis)[4]，西红柿等[31]的研究是相符的，其原因可能是植物需要消耗一定的能量来抵消盐胁迫的影响[25]。许多学者认为盐胁迫对植物生长的抑制效应在于Na+/Cl-离子毒害产生的直接效应和盐离子引起土壤/植物的渗透胁迫而导致的间接效应共同作用的结果[32-33]。另外，本实验中，接种 AM 真菌显著提高了白芨的总干重，AM真菌对白芨生物量的促进作用主要体现在生物量积累上，对根冠比即生物量的分配并没有显著影响，这与以往的研究并不相符[4，34]。接种AM真菌对白芨养分吸收的促进作用主要体现在各个盐处理下的地上部分N含量和高盐胁迫下的地下部分P含量(见图3)。AM真菌对植物生长的增强效应究其原因，大多学者认为是由于菌根增强了矿质养分特别是难移动的 P元素的吸收[33，35]，据估计，植物吸收的P元素有将近80%是由AM真菌的根外菌丝提供的，这可能是由于与非菌根植物相比，AM 真菌的菌丝网络扩大了根系在土壤中的吸收范围[36]，但也有研究认为 AM 真菌的效应在于其提高了植株K元素的含量[29]。而本实验中，对照盐浓度下，AM真菌对白芨总干重的促进作用很大程度上应得益于菌根对地下部分N元素吸收的促进作用，这与吴建新等人[37]对草莓的研究是相符的。已有研究表明，N元素吸收的提高有利于减少Na离子的毒害作用从而间接地有利于维持植物叶绿素含量[38]。

3.2 盐胁迫下AM真菌对白芨的菌根效应

值得注意的是，AM真菌对白芨生长的促进作用主要是在对照盐处理下，在高盐浓度下(200 mM NaCl)其促进效应减弱(见图2)。显然，当环境胁迫强度加大时，不仅植物生长受到抑制，同时还阻碍了AM 真菌的孢子萌发和菌丝生长，进而侵染率下降，这与本实验中高盐浓度下侵染率的显著降低是相符的[11]。侵染率的高低是AM真菌功能发挥的基础[39]。已有研究表明，随着盐胁迫的加剧，AM真菌对植物耐盐性的促进作用将会降低，甚至转变为单方或双方受抑制[40-41]。我们的研究表明，随着盐胁迫浓度的增加，白芨的菌根生长效应(MGR)降低，这与张义飞[4]的研究并不相符，说明高盐胁迫对 AM 真菌的生长具有一定的抑制效应，AM真菌的存在对其生长是不利的，这可能是因为在菌根共生体系中，AM真菌虽然可以促进宿主植物养分的吸收，但同时AM真菌要消耗宿主植物固定的高达20%的碳物质，因此，在胁迫环境下，宿主植物的碳损耗大于其养分吸收的收益，从而导致菌根生长效应下降[15]。事实上，在逆境条件下，AM和植物共生体可能面临着各种各样影响其互利共生关系的生物和非生物因素，其综合作用可能会加速或削弱AM真菌对植物生长的促进作用[11]。与此同时，白芨对N元素的依赖性(MNR)下降而对 P元素的依赖性(MPR)升高，说明随着盐浓度升高，白芨对N元素的依赖性转变为对P元素的依赖性，而以往对羊草的研究则发现随着盐浓度升高，植物对P的依赖性转变为对K的依赖性[4]。在今后的研究中有必要从多个角度开展盐胁迫下接种 AM 真菌植株的响应格局研究，以便全面深入揭示其响应机理。

以上研究结果表明，盐胁迫显著降低了白芨根系侵染率、总干重和地上部分P含量；接种AM真菌则显著提高了白芨根系侵染率、总干重、地上部分N含量及地下部分P含量，说明接种AM真菌对白芨的抗盐性具有一定的提高作用。尤其是，在高盐胁迫下，接种 AM 真菌显著提高了白芨地上部分N含量和地下部分 P含量，我国南方亚热带多为贫瘠的酸性红壤[42]，这对于提高白芨产量及促进白芨对矿物养分的吸收无疑是非常有利的，可尝试在实际生产实践中加以推广应用。然而，由于本实验盐处理水平的限制，无法获知确切的 AM 真菌可应用的盐胁迫浓度范围，在今后的深入研究中有待于设置多个盐处理水平梯度并从多个层面揭示AM真菌对白芨生理生长的调控机理。