周洲 李玉芝 卞敏霞 葛兴云 于金华

(南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室，南京医科大学附属口腔医院牙体牙髓科，江苏 南京 210029)

牙本质的仿生再矿化是一种在仿生分子的调控下，模拟生物自然矿化过程，是在脱矿牙本质基质或晶体表面形成新矿化物质，从而修复脱矿区的微创治疗手段[1-3]。牙本质仿生再矿化不但可以治疗牙本质过敏，还可以阻止龋病的早期发展，起到防龋护齿的作用[4-6]。

仿生再矿化与仿生分子的选择密切相关，酪蛋白磷酸肽-纳米无定形磷酸钙(CPP-ACP)是从牛奶中经胰蛋白酶消化提取出来的多肽复合物[7]，是一种具有良好的生物相容性的仿生分子，可使钙和磷酸根离子保持过饱和浓度从而进入牙体脱矿区，起到抑制牙体脱矿以及促进再矿化的作用[8-10]。CPP-ACP以往多用于牙釉质的再矿化中，并取得了一定的再矿化效果[11-13]，但在牙本质的再矿化中报道较少，可能是由于单独使用CPP-ACP无法模拟牙本质的生物自然矿化过程，从而无法获得理想的再矿化效果。三聚磷酸钠(TPP)是一种无定形水溶性线状聚磷酸盐，不仅具有良好的生物相容性，同时也可以作为牙本质非胶原蛋白仿生类似物即仿生分子使用。TPP可以通过磷酸化牙本质胶原纤维，增加胶原表面成核位点来诱导胶原矿化，实现与胶原微纤维的特异性结合[14-15]。本研究旨在通过CPP-ACP在TPP辅助下对脱矿牙本质进行仿生再矿化，从而探讨再矿化效果。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

CPP-ACP乳剂(GC公司，日本)，TPP(分析纯，国药集团试剂有限公司)，35%磷酸凝胶(Gluma Etch 35 Gel，Heraeus公司，德国)，离体牙(南京医科大学附属口腔医院外科收集)，人工模拟唾液(以ISO/TR10271为标准配方配置)，衰减全反射傅里叶变化红外光谱仪(NEXUS670，Nicolet公司，美国)，低速切割机(Isomet，Buehler公司，美国)，扫描电子显微镜(SU3500，HITACHI公司，日本)，能谱分析仪(AZtecEnergy，Oxford Instruments公司，英国)，透射电镜(Tecnai Spirit 120 kV，FEI公司，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1脱矿牙本质样片的制备 收集口腔门诊外科拔除的患者的完整第三磨牙，排除龋坏裂纹等，去除表面牙釉质，以慢速切割机垂直牙长轴切割制成4 mm×4 mm×1 mm大小的牙本质样片30片，用不同细度的砂纸依次打磨光滑，放入超声清洗机中去离子水超声清洗5 min，备用。其中6片作为阳性对照不做任何处理；其余24片牙本质样片先以35%磷酸凝胶涂抹表面60 s致牙本质脱矿；脱矿的牙本质样片在超声清洗机中通过去离子水清洗，干燥备用。

1.2.2牙本质样片的分组以及处理 将牙本质样片根据处理方法不同随机分成5组，每组各6片。CPP-ACP再矿化组(A组)：将脱矿牙本质样片实验面均匀涂抹CPP-ACP乳剂2 min，去离子水冲洗干净后，放入15 mL盛有模拟唾液的试管中，试管置入37 ℃恒温水浴锅中，每24 h涂抹3次，每次间隔8 h，每次均更换模拟唾液，共作用21 d，取出牙本质样片，超声清洗机中去离子水清洗2 min，干燥后备用；CPP-ACP+TPP联合再矿化组(B组)：在A组的基础上，先将脱矿牙本质样片浸入25 g/L TPP的溶液中2 h，清洗干燥后，再涂抹CPP-ACP 乳剂2 min；单独模拟唾液再矿化组(C组)：将脱矿牙本质样片放入15 mL盛有模拟唾液的试剂管中，试管置入37 ℃恒温水浴锅中，每24 h更换模拟唾液，作用21 d后将矿化的牙本质样片取出，超声清洗机中去离子水清洗2 min，干燥以后备用；阴性对照组(D组)：脱矿牙本质样片不做任何处理；阳性对照组(E组)：没有任何处理的天然牙本质样片。

1.2.3牙本质样片表面的官能团检测分析 采用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)对天然牙本质样片、脱矿牙本质样片、TPP处理的脱矿牙本质样片(脱矿牙本质样片经25 g/L TPP溶液浸泡2 h)以及CPP-ACP在TPP辅助下再矿化21 d的脱矿牙本质样片进行官能团分析，设定的ATR-FTIR工作参数如下：分辨率4 cm-1，扫描范围700～4 000 cm-1，扫描次数32次。

1.2.4牙本质样片的微观形态观察 处理21 d后的5组牙本质样片经干燥、喷金后分别置于扫描电镜(SEM)下观察表面微观形态变化情况。A、B组牙本质样片经脱水、包埋、切片后于透射电镜(TEM)下进行观察，评价标准为牙本质胶原纤维是否出现周期样“横纹”的典型纤维内再矿化结构。

1.2.5牙本质样片钙/磷元素摩尔比的检测 处理21 d后的5组牙本质样片，每组各取1个样片于其表面随机选取5个点，通过X射线能谱分析(EDS)检测羟基磷灰石主要成分钙/磷元素摩尔比。采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理，所得数据进行单因素方差分析，以P<0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1 牙本质样片表面官能团检测分析结果

曲线1代表天然牙本质样片；曲线2代表脱矿牙本质样片；曲线3代表TPP处理的脱矿牙本质样片；曲线4代表CPP-ACP在TPP辅助再矿化21 d后的脱矿牙本质样片

2.2 牙本质样片表面形貌SEM下观察结果

SEM下观察可见，E组牙本质小管大部分处于封闭状态；D组牙本质样片完成了脱矿，牙本质小管基本处于开放状态；A组牙本质样片表面有较多矿化物沉积，部分牙本质小管完成了封闭，但表面矿化物的沉积不均匀；B组在脱矿牙本质样片表面均匀沉积大量再矿化物，牙本质小管基本完成了封闭；C组在脱矿牙本质样片表面只见少量再矿化物沉积，几乎未见有牙本质小管封闭(图2)。

A～E分别为A～E组，1 000倍

2.3 牙本质样片的TEM下观察结果

TEM下观察结果显示，A组样本牙本质胶原纤维内几乎未见周期样“横纹”结构，B组样本牙本质胶原纤维内可见周期样“横纹”结构，纤维内有晶体物质形成(图3)。

A、B分别为A、B组，B组中白色箭头所指为出现的周期样“横纹”结构，30 000倍

2.4 牙本质样片钙/磷元素摩尔比检测结果

EDS检测结果显示，A～E组样本钙/磷元素摩尔比分别为1.57±0.03、1.62±0.03、1.51±0.03、1.48±0.05、1.65±0.04，其中B组钙/磷元素摩尔比显著高于A、C及D组(F=19.27，P<0.05)；B组与E组比较差异无显著性(P>0.05)。

3 讨 论

CPP-ACP作为一种生物相容性较好的仿生分子以往常用在牙釉质的再矿化中，并取得了一定的成效，但在牙本质的再矿化中应用较少，这主要是牙本质结构的复杂性决定了CPP-ACP作用于牙本质再矿化的难度要高于在牙釉质中的再矿化[16-17]。牙釉质90%以上是由羟基磷灰石等无机物构成，只有极少量的有机成分，这种结构特征便于CPP-ACP以钙、磷酸根离子为原料在脱矿的牙釉质表面以残存磷灰石为模板完成晶胞的生长和复制[18-20]。牙本质结构的复杂性要远远高于牙釉质，除了无机成分，还具有大量的有机成分，其中主要是胶原纤维和非胶原蛋白。在天然牙本质再矿化中，再矿化过程不是简单的矿化离子的生长沉积，而主要是依靠非胶原蛋白调控钙、磷酸根离子等以牙本质胶原纤维为模板完成有序排列的过程[21-22]。本研究即是通过仿生再矿化来模拟生物自然的再矿化过程。

单独使用CPP-ACP很难完成这种生物的自然矿化，CPP-ACP可以稳定钙、磷酸根离子在过饱和浓度进入脱矿区，但很难真正进入到牙本质胶原纤维内。要实现牙本质的仿生再矿化，不仅要完成矿化物在胶原纤维表面的沉积，同时矿化物要能进入到胶原纤维内部，完成纤维内的再矿化[23-25]。TPP作为一种线状聚磷酸盐同样可作为仿生分子，TPP可以磷酸化牙本质胶原纤维，并且标记胶原纤维的成核位点，即模拟了牙本质非胶原蛋白的N端功能团[26-27]。在本研究中，首先通过TPP溶液磷酸化脱矿牙本质的胶原纤维，以胶原纤维作为矿化模板并在胶原纤维上标记再矿化的成核位点，然后通过CPP-ACP稳定和运输矿化原料到标记好的成核位点上，从而模拟自然矿化过程中晶体的自组装和排列过程完成再矿化。

本研究分别从牙本质样片表面官能团变化、表面微观形态变化、内部结构改变以及矿化后钙/磷元素成分变化等多方面综合分析了CPP-ACP在TPP协同作用下对脱矿牙本质的再矿化效果。结果显示CPP-ACP和TPP两种仿生分子最大限度地模拟了牙本质的自然再矿化过程，同时实现了牙本质的纤维内和纤维外的再矿化，此矿化方法可作为脱矿牙本质的一种精准、有效的仿生再矿化方法。