王 淼 芮 雪 罗慧丽 韩春梅*

（1塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

鹿茸是迄今为止发现的唯一能够再生的哺乳动物器官［1］，而器官再生为人类研究提供完美的哺乳动物模型［2］。鹿茸的生长与再生能力是基于干细胞的分裂［3］。在创伤条件下，其微环境变化对鹿茸干细胞的影响可能是促进鹿茸再生及快速生长发育的重要原因。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）是最早发现能够使创伤后肝脏再生的细胞因子［4］，后续研究表明，HGF在细胞、组织修复和再生中起着重要作用。Li等［5-6］对增殖区不同类型组织进行研究，在分子水平揭示了鹿茸快速生长的机制。因此，研究鹿茸组织中的HGF基因及表达特征，为了解HGF基因在鹿茸组织中的调控作用和生长发育机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物与样品采集

选取2～3岁健康的雄性塔里木马鹿3头，使用陆眠宁（1.0 mL/100 kg）麻醉马鹿采用锯割法采集新鲜鹿茸顶端组织，用75%的乙醇消毒后，垂直于鹿茸生长轴切取约4～6 cm的鹿茸组织，分离出茸皮、间充质、软骨、骨组织各100 mg/每块，放入液氮罐备用。

1.1.2 主要试剂

反转录试剂盒、PCR试剂盒、大肠杆菌DH5α、pMD19-T载体、凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa；Trizol、IPTG 均购自 Thermo Fisher；一抗 Anti-HGF（QC45570）购自SIGMA有限公司；二抗（PV-6001）购自中衫金桥；山羊血清封闭液（SL038）、DAB染色剂试剂盒（DA1010）均购自Solarbio；PBS缓冲液购自TBA公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇、氨苄青霉素、NaOH、NaCl等试剂产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成

根据GenBank上公布的牛的HGF（AB110822.1）和 GAPDH（NM_001034034.2）基因 mRNA 序列，用Primer5软件设计塔里木马鹿HGF5基因和GAPDH基因引物，引物序列分别为F:TACCTAATTATGGGTGCACAATTC，R:TCCATTTTGCATAATATGCCACTC；F:TGTTTGTGATGGGCGTGAACCA，R:ATGGCGTGGACAGTGGTCATAA。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取及cDNA合成

液氮罐中取出备用鹿茸组织，放入装有液氮的研钵中研碎，转入1.5 ml离心管中，利用Trizol法提取四个组织的总RNA。用RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit进行反转录，操作方法按说明书进行。

1.2.3 PCR扩增及克隆

以1.2.2获得的4个组织的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL：Prime STAR Max Premix（2×）25 μL，cDNA 3 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 20 μL。PCR扩增程序：94℃ 3 min预变性；94℃ 30 s变性、55℃ 15 s退火、72℃ 30 s延伸，共35个循环；72℃5 min总延伸。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

对PCR产物进行胶回收后，pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中［7-10］，涂板于含有Amp+（100 mg/ml）的LB培养基上，37℃过夜。进行菌落PCR，选择阳性菌落摇菌，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.4 塔里木马鹿鹿茸HGF基因序列分析及比对

对获得的塔里木马鹿鹿茸HGF部分基因编码序列进行BLAST分析。

1.2.5 免疫组化

首先将割取鹿茸进行消毒切至0.5～1 cm组织块，放入倒有Otc的包埋支撑盒中切至6 μL厚度存放-80℃待用。然后将切片放入冷丙酮中固定10 min（温度4℃），PBS冲洗三次；每张切片加入适量内源性过氧化氢物酶阻断剂，室温孵育10 min，使用PBS缓冲液冲洗3次；每张切片滴加50 μL的10%山羊血清（PBS稀释）在湿盒中进行密封10分钟，以防止切片变干；倾去山羊血清，不需要冲洗干净，滴加一抗后在4℃冰箱里过夜；使用PBS缓冲液冲洗3次（1次/3 min）；滴加酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20 min；使用PBS缓冲液冲洗3次（1次/3 min）；加入适量新鲜配制的DAB染色剂，室温孵育5～8 min，自来水冲洗；苏木素染色液孵育20 s，自来水冲洗；使用倒置显微镜进行观察。

2 结果

2.1 鹿茸RNA提取

塔里木马鹿鹿茸不同组织的总RNA琼脂凝胶电泳检测结果如图1所示。检测结果显示，4个组织均出现3条电泳条带，分别为RNA的28S、18S和5S。从亮度上可见28S/18S约为2倍，所提取的RNA较完整，符合本实验要求，可以进行下一步的操作。分别将四种RNA逆转录为cDNA，得到的cDNA溶液于-20℃保存。反应产物可以直接作为模板进行PCR扩增反应。

图1 鹿茸不同组织总RNA检测结果

2.2 鹿茸HGF基因克隆

取2.1获得的RNA样品通过PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测得到一条约349 bp的目的条带，与预期片段大小相符，可进行下一步试验。结果图2所示：

图2 塔里木马鹿鹿茸HGF基因PCR扩增结果

2.3 测序结果与序列分析

HGF基因RNA的测序结果将PCR获得的HGF部分序列，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，获得349 bp，以下为测序拼接结果如下：

ACCTAATTATGGGTGCACAATTCCTGAAAAAA CCACTTGCAGTGTTTATGGCTGGGGCTACACTGGAT TGATCAACTCAGACGGTCTACTACGAGTAGCACAT CTCTATATTATGGGGAATGAGAAATGCAGCCAATA CCATCAAGGGAAGGTGACTCTCAATGAGTCTGAAA TATGTGCTGGGGCTGAAAATATTGTATCAGGACCA TGTGAGGGAGATTATGGTGGCCCACTTGTTTGTGA ACAACATAAAATGAGAATGGTTCTTGGTGTCATTG TTCCTGGTCGTGGCTGTGCCATTCCAAACCGTCCTG GCATTTTTGTCCGAGTGGCATATTATGCAAAATGG

本试验扩增出HGF的RNA序列为349 bp，编码116个氨基酸。通过比对塔里木马鹿HGF部分基因与瘤牛（基因序列号XM027539811.1）、普通牛（NM001031751.2）、白尾鹿（XM020876600.1）、山羊（XM013963237.2）、绵羊（XM027968556.1）、野 猪（XM021063486.1）、野骆 驼（XM006194336.2）、马（XM023639072.1）、野驴（XM014855377.1）、野 马（XM008538444.1）相应的同源性分别为98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%、96.56%、95.70%、95.42%、95.42%、95.42%。HGF基因在物种间的高同源性表明它们在进化过程中非常保守，即在不同物种中的功能具有相似性。

2.4 HGF基因在塔里木马鹿鹿茸不同组织中的表达

经过免疫组化检测，HGF基因在鹿茸茸皮、间充质、软骨和骨组织中均有阳性反应，且茸皮组织和软骨组织中阳性反应表达明显，间充质组织和骨组织中阳性反应表达微弱。

HGF在塔里木马鹿鹿茸皮层的表达免疫组化结果见图3。

图3 鹿茸茸皮组织免疫组化结果

在倒置显微镜下可以看到，茸皮是由表皮、真皮和皮下结缔组织组成，真皮由网状结构构成，并且存在大量毛囊和皮脂腺，皮下结缔组织中由许多血管和纤维的分布（见图3中A、B、C和D）。从图片中观察到鹿茸茸皮组织免疫组化实验组有黄褐色阳性反应出现，主要分布在鹿茸茸皮组织真皮表皮中间基底层和毛囊周围的皮脂腺上（见图3中B、C和D），对照组为阴性反应（见图3中A），说明鹿茸茸皮组织中存在肝细胞生长因子的表达，且表达明显。

塔里木马鹿鹿茸HGF基因在间充质组织中也有表达，但表达微弱如图4。

通过倒置显微镜下观察，可以明显看到鹿茸间充质层组织中细胞排列紧密，大部分细胞核细长呈梭形，排列方向与生长轴垂直，少数与生长轴平行，存在血管结构（见图4中E、F、G和H）。从图片中观察到鹿茸间充质组织免疫组化实验组中间充质细胞和基质中有少量的黄褐色弱阳性反应出现（见图4中F、G和H），对照组为阴性反应（见图4中E），说明鹿茸间充质组织中存在肝细胞生长因子的表达，但表达微弱。

图4 鹿茸间充质组织免疫组化结果

塔里木马鹿鹿茸HGF基因在软骨层中也有表达，阳性信号特征鲜明，如图5。

图5 鹿茸软骨组织免疫组化结果

通过倒置显微镜下观察，可以明显看到鹿茸软骨组织是由软骨细胞、软骨基质和胶原纤维组成，软骨细胞形态极不规则，细胞核仁不明显，围绕着管道呈螺旋状排列，有一定的规律，基质内具有明显的隐窝可以将基质和软骨细胞隔开，软骨组织中存在大量血管（见图5中I、J、K和L）。从图片中观察到鹿茸软骨组织免疫组化实验组中软骨细胞和基质有阳性反应出现（见图5中J、K和L），对照组为阴性反应（见图5中I），说明鹿茸软骨组织中存在肝细胞生长因子的表达，且非常明显。

塔里木马鹿鹿茸HGF基因在骨组织中表达微弱，如图6。试验组骨细胞及其周围有黄褐色阳性反应出现（N、O和P）对照组M阴性反应。

图6 鹿茸骨组织免疫组化结果

在倒置显微镜下可以看到，骨组织是由细胞、纤维和基质组成，分布大量排列不规则的骨小梁，骨小梁附近分布着大量血管（见图6中M、N、O和P）。从图片观察到鹿茸骨组织免疫组化200X实验组骨细胞及其周围有黄褐色阳性反应出现（见图6中P），对照组为阴性反应（见图6中M），说明鹿茸骨组织中存在肝细胞生长因子的表达，但是表达微弱。

3 讨论

肝细胞生长因子（HGF）发现于上个世纪，从肝细胞中鉴定并克隆得到。随着后期研究发现HGF系统广泛表达于多种组织并参与复杂的生物学过程，调节细胞生长、运动以及组织形态发生，对多种组织器官的发生发育、修复再生有着至关重要的作用［11］。Liu等［12］发现HGF上调MSCs的c-Met和磷酸化Met的表达，增强其肝保护作用。Transwell检测显示HGF能够促进MSCs迁移，而且介导了BMSCs诱导的肝修复。Bai L［13］发现该信号促进少突胶质细胞增殖并和神经元的发育密切相关。Wen Q等［14］发现HGF浓度的连续变化对体内MSCs的增殖和成骨分化有明显的作用。

现阶段研究中，大多学者把鹿茸再生作为再生医学热点研究模型［15-16］。因此，本研究以塔里木马鹿鹿茸HGF基因为候选基因。将塔里木马鹿鹿茸HGF与其他物种进行比对分析，发现与瘤牛、普通牛、白尾鹿、藏羚羊和绵羊的HGF核苷酸序列同源性较高，分别为 98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%。本研究利用免疫组化试验检测塔里木马鹿鹿茸顶端茸皮组织、间充质组织、软骨组织和骨组织HGF基因的表达，结果显示，HGF在茸皮组织和软骨组织中表达明显，在骨组织和间充质组织中微弱。说明HGF基因对鹿茸顶端生长发育有调节作用，为进一步研究HGF的功能和鹿茸快速生长的调节机制奠定基础。目前，关于塔里木马鹿HGF基因在分子水平上研究的报道较少，其具体生长调节机制还需进一步研究。

4 结论

本试验通过PCR方法扩增、克隆塔里木马鹿鹿茸中HGF部分外显子序列349 bp，与其他物种序列比对结果表明，塔里木马鹿鹿茸中HGF基因序列与瘤牛、普通牛、白尾鹿、藏羚羊和绵羊等同源性较高，分别为 98.57%、98.57%、97.99%、97.71%、97.42%。免疫组化检测结果显示，HGF在茸皮组织和软骨组织中表达明显，在骨组织和间充质组织中微弱。