张芹，孔令军，屈长义，冯建新

(1. 河南省水产科学研究院， 河南 郑州 450044； 2.河南农业大学牧医工程学院， 河南 郑州 450002)

团头鲂(Megalobramaamblycephala)含肉率高，肉味鲜美，是中国池塘养殖的主要品种。团头鲂自然分布非常狭窄，主要分布在湖北省梁子湖、淤泥湖以及江西省鄱阳湖，目前团头鲂选育中基础群体的原种大部分来源于以上三个湖泊中[1-2]。伊河为黄河支流，历史上早已有关于伊河鲂的记载。“伊河鲂”在分类上属于鲂属团头鲂，是近年来选育出来的一个优良新品系[3]，梁子湖盛产素有“武昌鱼”美称的团头鲂，是人工养殖团头鲂苗种的一个主要来源，本研究通过对产于长江流域的梁子湖团头鲂和黄河流域的伊河团头鲂两个群体进行对比，希望找到两个群体团头鲂之间的差异，为团头鲂的选育和伊河团头鲂的种质保护提供技术支持。

同工酶作为重要的分子标记物，在遗传学、育种学、生理学及分类学等生命科学学科中有着广泛的应用[4-5]。同工酶技术可以从蛋白质水平上显示种质资源的遗传多样性，通过分析同工酶的不同谱带，可以鉴定同一物种不同种质之间的遗传差异[6]，也可作为研究不同种质之间亲缘关系的一种方法，酶谱越相近，物种亲缘关系也越相近[7]。同工酶在水产动物上主要用来研究亲缘关系、鉴定物种分类，是一种重要的遗传标记[8]，和其他种质鉴定技术相比，同工酶技术由于不受环境条件制约，鉴定速度快且相对经济[6,9]，应用较为广泛。

本研究采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对两个群体团头鲂5种组织中的乳酸脱氢酶(LDH)和酯酶(EST)同工酶的表达进行了研究，分析2个群体团头鲂之间同工酶酶谱的差异，旨在了解不同组织中2种同工酶表达的相似性和差异性，筛选出伊河团头鲂的特征生化遗传参数，为其种质标准的制定和种质资源鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

团头鲂群体为池塘养殖群体，伊河团头鲂于2016年10月采自河南省嵩县伊河鲂育种中心，共30尾，体重为(823.80±85.74)g，体长为(372.30±19.85)cm；梁子湖团头鲂于2016年10月采自湖北省鄂州市国家级团头鲂原种场，共30尾，体重为(720.20±74.59)g，体长为(355.00±17.88)cm。

1.2 形态测定

伊河团头鲂形态的测定按照GB/T 18654.3—2008《养殖鱼类种质检验》中的相关规定进行，用游标卡尺(精确度0.1 mm)对样品进行测定。

1.3 组织酶液的制备

随机选择2个群体的团头鲂各8尾，尾静脉采血，4 ℃冰箱保存4 h，析出血清。将实验鱼在水中剪鳃放血后，迅速解剖取眼睛、肌肉、心脏和肾脏等组织，整个实验过程在冰浴条件下完成，以减少实验鱼的痛苦。取出后的组织用4 ℃生理盐水洗净，同析出的血清一起存放于-70 ℃超低温冰箱中保存。

按1∶10(m/v)的比例加入预冷的0.2 mol/L (pH 7.4)磷酸盐缓冲液，冰浴条件下匀浆并分装于离心管中，每个离心管中加入0.8 mL 组织匀浆液，0.4 mL 氯仿，振荡混匀。离心(4 ℃，5 000 r/min)5 min，取上清液分装后放于-70 ℃超低温冰箱中保存备用。电泳时，将上清液和染色剂按照5∶1(V/V)的比例混匀上样，制备好的血清可直接和染色剂按照5∶1的比例混匀后使用。

1.4 电泳和染色

采用聚丙烯酰胺垂直板电泳技术[10]进行同工酶电泳，先对2个群体团头鲂不同组织的乳酸脱氢酶(LDH)和酯酶(EST)进行电泳，比较不同群体间同工酶酶谱的差异，然后选择酶带清晰的眼睛组织和血清进行下一步实验，分析2个群体团头鲂内部个体间的差异。分离胶浓度7%，浓缩胶浓度4%，采用Tris-柠檬酸凝胶缓冲系统，200 V电泳2～3 h。LDH采用NAD染色法[11]， EST采用乙酸萘酯染色法[12]。

2 结果与分析

2.1 伊河团头鲂的形态特征

伊河团头鲂体高而侧扁，呈菱形。头小，吻钝圆，口端位，口裂较宽，上下颌角度小。头后背部显著隆起。无须。眼中等大，位于头部的前侧部。上、下颌角质薄而窄，上颌角质呈三角形。上眶骨略呈三角形。背鳍不分枝鳍条为硬刺，最后一枚不分枝鳍条粗壮，其长度一般短于头长。胸鳍较短，不至或仅达腹鳍基部。腹部自腹鳍至肛门间有皮质棱。尾柄短，尾柄高大于尾柄长。体呈青灰色，体侧鳞片基部浅色，两侧灰黑色，在体侧形成数行浅色纵纹。实验所用伊河团头鲂的基本性状比例值见表1。

表1 伊河团头鲂实验组可量性状测定结果Tab.1 Determination of measurable traits for Megalobrama amblycephala samples from Yi River n=30

2.2 乳酸脱氢酶同工酶在2个群体团头鲂不同组织中的表达

乳酸脱氢酶同工酶在2个群体团头鲂的眼睛、肌肉、心脏、肾脏和血清等组织中共检测出6条酶带(图1)。伊河团头鲂群体在肾脏组织中检测出6条带，眼睛和心脏组织中检测出5条带，肌肉组织和血清中检测出4条带。梁子湖团头鲂群体在肾脏组织中检测出6条带，眼睛、肌肉和心脏组织中检测出5条带，血清中检测出4条带。2个群体乳酸脱氢酶同工酶表达相同的地方：在眼睛组织中都检测出5条带，并且5条带的亮度基本相同，酶活性相同；在心脏组织中检测出5条带，其中LDH2和LDH3活性高，条带较亮；在肾脏组织中均检测出6条带，其中LDH1为其他组织中未检测到的，LDH2和LDH6条带亮，酶活性较高；血清中检测出4条带，LDH5和LDH6条带亮，活性高，但血清的酶活性整体低于其他几个组织中酶的活性。2个群体同工酶表达不同的地方：在肌肉组织中梁子湖群体检测出5条酶带，伊河群体检测出4条带，伊河群体缺少LDH2条带。LDH同工酶在眼睛组织中5条酶带清晰可辨，各条带亮度差异不大，因此选择眼睛组织做进一步的分析。

2.3 酯酶同工酶在2个群体团头鲂不同组织中的表达

酯酶同工酶在2个群体团头鲂的眼睛、肌肉、心脏、肾脏和血清等组织中共检测出4条酶带(图2)。伊河团头鲂群体在眼睛、肌肉、心脏和肾脏组织中检测中2条带，分别为EST1和EST4，其中肾脏组织中EST1和EST4条带亮度较高，酶的活性较高，而其他三个组织中EST同工酶活性较弱；血清中也检测出2条酶带，其中EST2没有出现在其他组织中，EST1条带亮度高，酶活性强。梁子湖团头鲂群体在眼睛、肌肉、心脏和肾脏组织中检测出2条带，分别为EST1和EST4，其中肾脏组织中EST1和EST4条带亮度较高，酶的活性较高，而其他3个组织中EST同工酶活性较弱；血清中也检测出2条酶带，其独有的EST3没有出现在其他组织中，EST1条带亮度高，酶活性强。2个群体EST同工酶表达相同的地方：在眼睛、肌肉、心脏、肾脏和血清等组织中的均检测出2条酶带。血清中的EST1条带亮度最高。2个群体同工酶表达不同的地方：伊河群体在血清中检测出的为EST2，而梁子湖群体检测出的为EST3，是两个不同的酶带。2个群体EST同工酶在血清中表达有差异，用血清进行下一步的同工酶分析。

2.4 乳酸脱氢酶同工酶在2个群体团头鲂不同个体中的表达

LDH同工酶在伊河群体不同个体眼睛组织中的酶谱条带清晰，个体间差异不大，5号个体LDH6活性略低于其他个体(图3A)；LDH同工酶在伊河群体不同个体血清中酶活性低(图3B)，大部分个体LDH3、LDH4条带不清晰。梁子湖群体不同个体眼睛组织中LDH酶谱条带清晰，8号个体LDH5活性低于其他个体(图4A)；梁子湖群体不同个体血清中LDH同工酶个体间存在差异(图4B)，1号个体和3号个体检测出5条酶带，其他个体为4条带。2个群体LDH同工酶在眼睛组织中均呈现5条清晰的谱带，而在血清中酶带不清晰，梁子湖群体LDH在血清中的表达存在个体差异。

2.5 酯酶同工酶在2个群体团头鲂不同个体中的表达

伊河群体不同个体眼睛组织中均可见EST1和EST4两条带，清晰可辨(图5A)。伊河团头鲂不同个体血清中酯酶同工酶检测出3条带(图5B)，EST1酶活性明显高于EST2和EST3，个体间的差异主要体现在EST2和EST3上。梁子湖团头鲂不同个体眼睛组织中酯酶同工酶检测出2条带，EST1条带较亮，酶活性高于伊河团头鲂群体的EST1(图6A)。梁子湖团头鲂不同个体血清中酯酶同工酶的酶谱中有EST1和EST2两条带，EST1酶活性明显高于EST2，个体间差异不大(图6B)。2个群体EST同工酶在眼睛组织中表达稳定，均为两条带，在血清中酶带条数存在差异，EST2仅出现在伊河群体中，梁子湖群体中未检出。

3 讨论

3.1 同工酶表达的组织特异性

同工酶是基因表达的产物，其表达受到诸多内外因素的影响，基因在各组织间的表达时间和强度上的不一致造成了不同组织同工酶酶谱的特异性[13]。LDH同工酶是糖代谢中是非常重要的一类氧化-还原酶类，LDH-A基因表达的酶类多在厌氧组织骨骼肌中优势表达，其功能是将丙酮酸还原为乳酸；LDH-B基因表达的同工酶多在含氧组织中优势表达，其功能是将乳酸氧化为丙酮酸[14]。本研究中肌肉组织中的LDH5活性明显高于其他组织，与叶星等[15]在团头鲂中和张涛等[16]在美洲鲥(Alosasapidissima)中的结果一致。LDH5为LDH-A基因表达，其主要作用是催化丙酮酸转化为乳酸，在肌肉这类厌氧性器官中含量较高，肌肉组织的主要功能是运动，与肌肉组织反应活跃的生理功能相一致。心脏组织中LDH1的活性明显高于其他组织，LDH1主要催化乳酸氧化成丙酮酸进入三羧酸循环，在心脏等好氧器官中含量多活性强，与心脏组织中糖的有氧代谢活跃相一致[17]。

酯酶同工酶能催化酯键水解，属于水解酶类，在酯代谢和生物膜的结构等方面发挥作用，硬骨鱼类中酯酶有单体和二聚体的类型[18]，其是由染色体上不同的基因或共显性的等位基因译制的，是直接的基因产物，所以在种属的鉴定和遗传研究方面作用重大[19]。本研究中眼睛组织和肌肉组织中都只检测出EST同工酶的2条酶带，与叶星等[15]和吴兴兵等[20]对团头鲂EST同工酶的研究结果一致。肌肉组织中检测出2条带，与余来宁等[21]、欧阳敏等[22]在团头鲂肌肉组织中检测出4条带的结果不同，可能是由于不同地域的团头鲂群体所导致的差异。血清中EST1的活性最强，明显大于EST2和EST3，这与欧阳敏等[22]对团头鲂EST酶的研究结果相同。酯酶具有解毒作用，泥鳅血清中酯酶的表达与其他组织有较大差异[23]，本研究血清EST同工酶在梁子湖群体中检测出3条带，在伊河群体中检测出4条带，群体间的差异主要表现在血清中，可能与2个群体不同的生态环境有关。

3.2 同工酶表达的个体差异

同工酶在同一物种不同个体中的表达也存在差异，张涛等[24]对达氏鲟(Acipenserdabryanus)的研究中发现眼睛晶状体和肌肉组织中出现LDH酶带差异，在肝脏组织中酶活性存在个体差异。本研究中LDH同工酶在活性和谱带上出现个体差异，如伊河群体5号个体和梁子湖群体8号个体眼睛组织LDH活性与其他个体有差异，梁子湖群体血清的LDH酶带与其他个体不同，可能与其个体所处的发育状态和健康状况有关。

酯酶同工酶具有明显的多态性，在不良环境的影响下会产生变异，酯酶的表达会有显著的变化[25-26]，本研究中伊河群体团头鲂有一条独有的EST2酶带，并且出现频率较高，可能和其独特的生存环境有关，需要做进一步的研究。

3.3 伊河团头鲂的生化遗传标记

LDH同工酶在肌肉组织和肾脏组织中有明显的拖尾现象，可能是采样过程中造成的污染，如实验鱼前期放血不彻底，导致肌肉取样时混入血液，对肌肉组织造成污染，以后取样过程中应该严格取样流程，尽量避免对样品造成污染；而肾脏组织成分本身比较复杂，取样时如果和其他组织分离不彻底，可能会造成污染，肾脏组织不适合作为生化遗传标记使用。国家标准《团头鲂》[27]中采用血清LDH作为生化遗传标记，而本研究中在伊河团头鲂血清LDH同工酶检测出多态性，条带清晰度不高，不适合作为生化遗传标记使用。心脏组织中的LDH同工酶条带分离效果较好，但是条带的清晰程度不如眼睛组织中的LDH同工酶。伊河群体LDH同工酶在眼睛组织中酶带清晰，表达更为稳定，个体间没有差异，初步确定用眼睛组织中的LDH同工酶作为鉴定伊河团头鲂的备选生化遗传指标。随机选择另外30尾样本鱼进行LDH同工酶分析，结果发现所有个体均呈单态，且酶带清晰，分离效果好，因此选取眼睛组织中的LDH同工酶作为鉴定伊河团头鲂种质的生化遗传标记。

4 结论

本研究通过聚丙烯凝胶电泳对两个群体团头鲂5种组织2种同工酶进行分析，发现LDH和EST同工酶在不同组织中均表现出特异性，个体间也存在差异，初步确定了眼睛组织中的LDH同工酶可作为鉴定伊河团头鲂种质的生化遗传标记。对伊河鲂同工酶的研究有利于对该群体开展种质鉴定和保护，研究结果可为团头鲂的育种工作提供参考依据。