李霞，胡楠，陈齐琳，王一，李水珍，徐思建，崔萌佳，李静*

(1.桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林 541006；2.桂林万禾农产品有限公司，广西 桂林 541006)

西番莲是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)草质藤本植物的果实，又称百香果、鸡蛋果、巴西果，是一种芳香可口的水果，有“果汁之王”的美誉，有紫、黄两种品种[1]。西番莲富含人体所需的17种氨基酸、β-类胡萝卜素、多种维生素以及各种微量元素[2]。西番莲叶可入药，性温，无毒，归肺经，有镇咳、消炎、镇痛等功效和抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等作用[3-8]。

常用的多糖提取方法有热水提取、酸碱提取、酶提取、超声波提取、微波提取等[9,10]，其中微波法具有缩短提取时间、降低能耗等特点[11]。响应面法(RSM)是一种有效的统计方法，近年来已成功用于开发、改进和优化生化过程。与其他方法相比，它可以更有效、更合理地安排和解释试验[12,13]。目前已经报道的有西番莲果皮多糖的提取以及西番莲叶黄酮类物质的提取[14,15]，而对西番莲叶多糖的提取尚未见报道。本文采用微波辅助提取西番莲叶多糖，考察料液比、提取功率、提取时间对多糖提取率的影响，用响应面优化其提取工艺，研究其体外抗氧化活性，为进一步资源化利用西番莲提供了理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西番莲叶(PassifloraedulisSims leaf)：产自桂林，由桂林万禾农产品有限公司提供；95%乙醇；苯酚；硫酸；无水乙醇；水杨酸；硫酸亚铁；三羟甲基氨基甲烷；邻苯三酚；三氯乙酸；H2O2；抗坏血酸；DPPH；K3Fe(CN)6；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠；TCA(三氯乙酸)；FeCl3。

TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器公司；ZY-GQ105型离心机 上海紫裕生物科技有限公司；FD-ICE型冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；DW900型微波炉 天津乐金电子电器有限公司；烘箱；水浴锅；旋转蒸发仪；电子天平。

1.2 方法

1.2.1 微波提取

取西番莲叶5 g，加入100 mL蒸馏水，在420 W下微波提取3 min，抽滤，滤液在4000 r/min下离心15 min，取上清液浓缩，加入4倍无水乙醇，于4 ℃下静置48 h，4000 r/min下离心15 min，取沉淀进行冷冻干燥，得到西番莲叶粗多糖(water extracted polysaccharide fromPassifloraedulisleaf，WPEL)。

1.2.2 多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。准确量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖溶液于试管中，定容至1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液和2.5 mL浓硫酸，混匀，反应20 min。精确量取蒸馏水1 mL，操作步骤同上，作为空白对照组，用紫外-可见分光光度计，于490 nm处测量吸光度，并绘制标准曲线。

取1 mL待测样品溶液于试管中，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。

1.2.3 单因素分析

研究料液比、微波功率以及提取时间对WPEL提取率的影响。按照1.2.1的提取工艺，设置微波功率420 W，提取时间3 min，考察不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)对WPEL提取率的影响；设置料液比1∶20 (g/mL)，提取时间3 min，考察不同微波功率350，420，490，560，630 W对WPEL提取率的影响；设置料液比1∶20 (g/mL)，微波功率420 W，考察不同提取时间1，2，3，4，5 min对WPEL提取率的影响。

1.2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果设计因素水平表，以料液比(A)、微波功率(B)和提取时间(C)为自变量，多糖提取量为响应值进行三因素三水平的响应面分析。采用响应面优化多糖提取工艺，试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素水平Table 1 The factors and levels of test

1.2.5 西番莲叶多糖体外抗氧化活性的测定

通过测定多糖样品的DPPH自由基清除率、还原能力、羟基自由基清除率及超氧阴离子自由基清除率来评价其体外抗氧化活性[16,17]。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

取2.0 mL待测液，加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液(以乙醇为溶剂)，混匀后避光反应0.5 h，在517 nm处测定其吸光值Ai；同时测定乙醇(2.0 mL)和DPPH(2.0 mL)的吸光值Ac，乙醇(2.0 mL)和待测液(2.0 mL)的吸光值Aj，以Vc作为阳性对照。DPPH自由基清除率计算公式：K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

1.2.5.2 还原性能力的测定

取0.5 mL待测液，加入0.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液与0.5 mL PBS溶液(0.2 mo1/L，pH为6.7)，于50 ℃反应20 min后立即冷却，加入0.5 mL 10% TCA溶液、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液和2.0 mL去离子水，摇匀，静置10 min，于700 nm下测定其吸光度值A，以Vc作为阳性对照。

1.2.5.3 羟基自由基清除率的测定

取9 mmol/L FeSO4与9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液各1 mL，摇匀后加入1 mL多糖溶液，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液启动反应，于37 ℃水浴30 min，冷却至室温，在510 nm下测吸光度A2。在其他条件不变时；用蒸馏水代替多糖做空白对照A1，以Vc替换多糖作为阳性对照，以蒸馏水替换H2O2溶液测定多糖本底液吸光度A3。羟基自由基清除率计算公式：K=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

1.2.5.4 超氧阴离子自由基清除率的测定

取4.5 mL Tris-HCl溶液(50 mmol/L，pH为8.2)于试管中，于25 ℃预热20 min，依次加入同样预热条件下的邻苯三酚溶液(25 mmo1/L)0.3 mL和0.2 mL样品，并迅速混匀倒入比色皿中，在319 nm处测定吸光度At，每30 s测1次，测定8次，以去离子水作为空白对照，计算邻苯三酚的氧化速率V0，以At为纵坐标，时间为横坐标作图，计算斜率Vt，以Vc作为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率计算公式：Y=(1-Vt/V0)×100%。

1.2.6 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 单因素试验图Fig.1 Single factor test

注:A为料液比；B为微波功率；C为提取时间。

由图1中A可知，多糖提取率随料液比增大先增大后减小，随着料液比的增加，处于植物内部的细胞与料液比形成的浓度差越来越大，因此驱使传送多糖的动力越大，多糖提取率越高。当料液比为1∶20时提取率最大，为10.70%，之后多糖提取率随料液比增大而有所下降，说明浓度差太大可能导致多糖传送的效率降低。

由图1中B可知微波功率对多糖提取率的影响，随着微波功率增大,提取率先增大后减小，当微波功率为490 W时多糖提取率为10.72%。微波功率的增大能够提高溶剂温度从而达到提升多糖提取率的效果；当功率超过490 W后，提取率降低，可能是微波功率过高会降解多糖，从而导致多糖提取率下降。

由图1中C可知，多糖提取率随着提取时间的增大先增大后减小，当时间大于3 min时，提取率下降，在一定时间内微波有利于细胞膜的破碎而使溶出物增多，但若时间过长时，会使多糖分子链在高温时发生断裂。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验结果

根据Box-Behnken设计的试验结果和方差分析见表2和表3。将试验值拟合为二阶多项式模型，多糖提取率Y与料液比(A)、微波功率(B)及提取时间(C)的二次方程为：

Y=11.21+0.060A+0.064B-0.016C+0.012AB-0.093AC-0.015BC-0.73A2-0.53B2-0.58C2。

表2 RSM试验设计结果Table 2 Experiment design and results of RSM

表3 RSM回归模型方差分析结果Table 3 Regression model variance analysis results of RSM

由表3可知，模型 P<0.0001，表明回归模型显著；失拟项P=0.0719>0.05，不显著；回归方程模型相关系数R2=0.9890，表明该方程有较好的估计预测能力，试验拟合的二阶多项式模型是有价值的[18]。试验值与预测值之间的相关性在图2B中显示了与对角线的低偏差。

图2 基于WPEL提取率的残差图(A)及试验值与预测值对应关系(B)Fig.2 Residual plot based on WPEL extraction rate (A) and the corresponding relation between actual values and predicted values (B)

很高的F值(70.50)与非常低的P值(P<0.0001)证实了数学模型的显著性。通过观察拟合的残差值(见图2中A)，表示残差的随机正态分布图，其值分布呈随机正态分布且分散无规律，表明模型具有很好的拟合能力。

图3 微波功率与料液比、提取时间的交互作用Fig.3 Interaction of microwave power with solid-liquid ratio and extraction time

由表3 中P值和F值可知料液比(A)、微波功率(B)及提取时间(C)中对试验影响较大的是微波功率，因此分析了微波功率与其他因素之间的交互作用。每对交互曲线必须大致平行且具有相同的趋势以验证模型的准确性。由图3可知，在料液比为1∶10和1∶30的条件下，微波功率对多糖提取率的影响没有交互作用；在提取时间为2 min和4 min的情况下，多糖的提取率存在相同轨迹，这些结果均表明参数之间不存在相互作用。

2.2.2 验证试验

根据响应面优化结果得到WPEL提取的最佳条件为：料液比1∶20.43 (g/mL)，提取功率494.3 W，提取时间2.98 min，多糖的提取率为11.21%。考虑到试验的可行性，取料液比1∶20 (g/mL)，提取功率495 W，提取时间3 min，在此条件下平行3次验证试验，多糖提取率为11.24%±0.50%，且提取率相对偏差较小，工艺条件稳定。

2.3 体外抗氧化活性的测定

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种用来对抗氧化成分的体外抗氧化性进行评价的稳定的自由基，清除率越大表明其抗氧化能力越强[19]。不同浓度的WPEL的DPPH·清除能力见图4中A，Vc对DPPH·的清除先增加而后趋于平稳(均在94.9%以上)，WPEL对DPPH·的清除作用在浓度范围内呈现一定剂量效应，且随着浓度的增大而提高，当浓度达到1.0 mg/mL时， DPPH·的清除率为88.79%。

2.3.2 还原能力

由图4中B可知，Vc和WPEL的还原性能力在浓度范围内呈现一定剂量效应，且随着浓度的增大而提高，当浓度达到1.0 mg/mL时，Vc和西番莲叶多糖的还原能力分别为3.46和0.567。

2.3.3 羟基自由基清除率

羟自由基是一种强氧化剂，其清除率是物质抗氧化作用的重要指标[20]。由图4中C可知，随着浓度的增大，Vc和WPEL对·OH的清除能力提高，当浓度达到1.0 mg/mL时，Vc和WPEL的清除率分别为98.78%、42.58%。

2.3.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

不同浓度的Vc和WPEL超氧阴离子自由基清除能力的测定见图4中D，在浓度在0.1～1 mg/mL的浓度范围内，Vc和WPEL的清除率随浓度的增大而增大，当浓度达到1.0 mg/mL时，Vc和西番莲叶多糖的超氧阴离子自由基清除能力分别为65.19%和12.31%。

图4 西番莲叶多糖的抗氧化活性Fig.4 The antioxidant activities of WPEL

3 结论

通过考察料液比、提取功率和提取时间对WPEL提取率的影响，并用Box-Behnken进行工艺优化，最佳提取工艺为：料液比1∶20 (g/mL)，提取功率495 W，提取时间3 min，在此条件下多糖提取率为11.24%±0.50%。体外抗氧化试验表明WPEL在一定浓度范围内具有抗氧化活性，且随浓度的增大而增大。当WPEL的浓度为1.0 mg/mL时，DPPH·清除率、还原能力、·OH清除率以及超氧阴离子自由基清除率分别为88.79%、0.567、42.58%和12.31%，其中WPEL对DPPH自由基的清除率最为明显，因此西番莲叶可以作为一种天然抗氧化剂资源而加以利用。