李来旭，刘鑫莹、潘添博，李 睿

1.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000

杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9 细胞。目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。

本研究自菌种保藏中心引进SF9 细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9 细胞系及及传染性法氏囊VP2 疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞SF9 细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。

1.1.2 试验试剂：SF9 无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9 细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9 无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。

1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/mL，每只冻存管分装1 mL。梯度冻存后放入-70 ℃冰箱过夜，放于液氮罐中保存。建立SF9 细胞的原始细胞库。

1.2.2 细胞形态 在细胞培养过程中取样，用倒置显微镜进行观察。

1.2.3 生长曲线 用SF9 无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。每天取样检测细胞密度，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 纯净性检测 按照2015 版《中国兽药典》开展无菌、外源病毒和支原体检验。

1.2.5 染色体分析 取SF9 细胞，处理后用姬姆萨染色液处理后显微镜观察，取100 个处于分裂中期的细胞核进行检查，观察染色体形状及染色体数量。

1.2.6 细胞致瘤性试验 裸鼠分为3 组，每组5 只，分别接种SF9 细胞、Hela 细胞及MRC5 细胞。接种后逐日观察有无结节或肿瘤形成。

2 结果

2.1 基础细胞库的建立

按上述方法冻存SF9 细胞，于液氮中保存。建立了SF9 细胞的基础细胞库，结果见表1。

表1 SF9 细胞基础细胞库的建立

2.2 细胞形态

SF9 细胞置显微镜下观察结果见图1，细胞均呈圆球形、胞体大小一致，边缘干净清晰，呈现较好的细胞悬浮生长状态。

图1 SF9 细胞形态

2.3 生长曲线

细胞呈S 型生长曲线，培养48 h，细胞密度约为3.4×106个/mL，培养72 h，细胞最大密度为4.0×106个/mL。

2.4 纯净性检验结果

按现行《中国兽药典》开展检验，SF9 细胞无菌、支原体及外源病毒检测结果均为阴性，纯净性好。

2.5 染色体分析结果

SF9 细胞内染色体数目较多，多为原点、短杆状和椭圆杆状。细胞的染色体条数主要分布在170 ～190 之间。SF9 细胞染色体数目呈正态分布，染色体异倍化的程度大体相同。

2.6 细胞致瘤性试验结果

结果见表2 及图2，SF9 细胞组接种裸鼠，5/5裸鼠淋巴结无结节形成，Hela 细胞组5/5 出现明显肿瘤，MRC5 组裸鼠均无结节形成。

表2 细胞致瘤性检验结果

图2 裸鼠致瘤性照片

3 结论

SF9 细胞作为杆状病毒表达系统常用的细胞株之一，在亚单位疫苗制备及产品研发中发挥重要作用，因此研究其细胞生物学特性具有重要意义。