谢 宪 梁 军,2 朱彦鹏 胡瑞瑞 程 元 张星耀,2

(1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业和草原局森林保护学重点实验室 北京 100091; 2. 昆嵛山森林生态系统国家定位观测研究站 烟台 264100; 3. 中国环境科学研究院 北京 100012)

松球壳孢菌(Sphaeropsissapinea)可引起针叶树种的枯梢病(Blodgettetal., 2005)。枯梢病的发生会影响多种针叶树的生长发育，尤其是松属(Pinusspp.)，已造成了重大生态破坏和经济损失(Stanoszetal.,1996)。经CABI统计，松球壳孢菌是世界上65个国家最常见的真菌类植物病原体之一(CABI, 2017)，目前已知松球壳孢菌广泛分布于北半球的松树自然分布区，这些树木已被引种至南半球(Smithetal., 2006)。松枯梢病已在我国中南、西南、华南、华东、西北等10余个省份的松林中发生，对松树林造成了严重的危害(叶建仁等, 2011)。

内生真菌在植物体内度过其全部或部分生命周期。当被定义为内生微生物时，这些菌种可能并不会对寄主植物造成直接伤害(Backmanetal., 2008; Rodriguezetal., 2009)，而且在某些情况下，内生菌对寄主会产生有益的影响(Arnold, 2007)。内生微生物通过种子从大树垂直传播到幼树，并在叶和茎系统中生长(Santangeloetal., 2015)，通过有性孢子或无性孢子水平传播(Arnoldetal., 2003)。已有研究表明，内生真菌在与寄主植物和其他内生微生物的互作中，能抵抗对植物病原菌的入侵，提高寄主植物的抗病性(Pakvazetal., 2016)。因此，植物内生微生物的群落结构的研究有利于解析寄主植物—病原菌—内生菌三者间的关系，对病害的预防和调控具有指导意义。

目前，关于松球壳孢菌侵染的研究主要集中在病原菌定殖和物种鉴定(Luchietal., 2014; Adamsonetal., 2015)、感染针叶的生化生理相应、激素和抗氧化代谢的变化(Huetal., 2018)和寄主抗性(Sherwoodetal., 2013)等方面。对感染松球壳孢菌的松树寄主的内部微生物，特别是病原菌影响的真菌多样性和群落结构的变化还未有研究。鉴于此，本研究选择无病斑与感染枯梢病不同发病情况的赤松(Pinusdensiflora)针叶为研究对象，利用高通量测序技术研究不同枯梢病发病状态下赤松针叶的内生真菌多样性以及群落结构的差异，为松枯梢病的微生物防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况及样地设置

昆嵛山(121°41′34″—121°48′04″E，37°11′50″—37°17′49″N)地处山东半岛东部，属暖温带季风气候，林区土壤属森林棕壤，以沙质壤土为主。昆嵛山是我国赤松原生地和天然分布中心，分布面积达11 546.3 hm2。共选取3块30 m×30 m标准样地(样地P，海拔212 m；样地Q，海拔196 m；样地R，海拔185 m)。样地立地条件均为中坡位，坡度为24°～26°，林分均为赤松纯林，赤松占比超过80%。

1.2 样品采集

2018年9月，在3块纯林样地内进行采样，由于枯梢病病原菌存在潜伏侵染的情况以及针叶不同发病情况，因此分别采集样地内全株无病斑赤松的针叶CC1(P1、Q1、R1)与染病赤松上无病斑针叶CC2(P2、Q2、R2)、染病较轻针叶CC3(病斑长度为针叶长度1/2以下,P3、Q3、R3)、染病较重针叶CC4(病斑长度为针叶长度1/2以上，P4、Q4、R4)。采用五点采样法采集样本，冲洗晾干后用75%乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3次，0.5%次氯酸钠溶液浸泡2 min后，再用无菌水冲洗3次，-20°C条件下保存(刘学周等, 2015)。将冲洗后的无菌水稀释至PDA培养基上，置于适宜条件下进行培养，经7天观察后，培养基内无真菌生长，证实针叶样本表面已无残留真菌。

1.3 真菌多样性测定

利用CTAB法对样本DNA进行抽提，完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测(Bullingtonetal., 2015)。将DNA样品在冰上融化后，离心并充分混匀，Nanodrop检测样品质量，取30 ng进行PCR扩增。PCR扩增体系： DNA样品，1.0 μL； Forward Primer(5.0 μmol·L-1)，1.0 μL； Reverse Primer(5.0 μmol·L-1)，1.0 μL； BSA(2.0 ng·μL-1)，3.0 μL； 2 × Taq Plus Master Mix，12.5 μL； ddH2O，6.5 μL。进行ITS扩增。ITS1区扩增引物序列为(5′-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3’)和(5′-TGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)。

PCR采用TransGen AP221-02： TransStart Fastpfu DNA Polymerase，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。扩增产物采用Illumina Miseq PE300平台，并构建Miseq文库以及Miseq上机测序。

1.4 测序数据处理与分析

OTU(operational taxonomic units)是在系统发生学或群体遗传学研究中为了便于进行分析，为某一个分类单元(品系、属、种、分组等)设置的同一标志。用uclust(Version 1.2.22)按照97%相似性将全部序列聚类，去除singleton的OTU，并得到代表序列和OTU表。用usearch按照97%相似性序列进行OTU聚类(不含单序列)，得到代表序列再将其全部序列按照97%相似度比对到OTU上形成OTU列表(Caporasoetal., 2010)。使用Mothur软件计算丰富度指数Chao1和多样性指数Shannon(刘满光等, 2018)。用FUNGuild数据库解析赤松内生真菌的营养型类别，置信水平仅选用probable和highly probable的OTUs及其类别； 为避免扩大功能类别的指定，序列数小于3的OTUs将被删除(Nguyenetal.， 2016)。使用R软件(v2.15.3)绘制PCoA图。测序数据已上传NCBI，编号为SUB5584140。

2 结果与分析

2.1 操作分类单元(OTU)及其多样性

测序结果显示，在赤松纯林CC的12个样品中共获得内生真菌有效序列405 240条，共计1 683个OTU。各样品Coverage测序深度指数统计分析结果见表1，结果显示采集针叶样本中覆盖率均接近于99%，稀释曲线平缓(图1)，说明各样本中的真菌物种信息被充分检测，结果能够代表各类针叶中内生真菌的真实水平。

根据内生真菌OTU数目，对样品中OTU组成进行分析，构建Venn图(图2)和群落结构柱状图(图3, 4)。在赤松纯林中不同染病程度的针叶中共有相同的OTU 223个，占OTU总数的13.25%，4类针叶中特有的OTU数目分别为273、169、202、96个，以CC1中特有OTU数目最多。

样本内生真菌的Chao1指数和Shannon指数统计分析结果见表1，无病斑赤松针叶内生真菌的Chao1和Shannon指数最高，即测得OTU数与种类数均最高，其次分别为染病赤松上的无病斑针叶、病斑长度为针叶长度2/1以下的赤松针叶、病斑长度为针叶长度2/1以上的赤松针叶。结果表明，随着病害侵染的加重，内生真菌丰富度及多样性呈现出下降的趋势。

表1 不同侵染级别的赤松针叶真菌丰度与多样性Tab.1 Abundance and diversity of fungi in different level of disease in needles of P. densiflora

图1 赤松样品真菌OTU稀释曲线Fig.1 OTU-based rarefaction curve of fungal communities in needles of P. densifloraCC1样本包括P1、Q1、R1； CC2样本包括P2、Q2、R2； CC3样本包括P3、Q3、R3； CC4样本包括P4、Q4、R4。 Samples of CC1 concludes P1, Q1, and R1; Samples of CC2 concludes P2, Q2, and R2; Samples of CC3 concludes P3, Q3, and R3; Samples of CC4 concludes P4, Q4, and R4.

图2 不同感病级别赤松针叶OTU分类的Venn示意Fig.2 Venn diagram of OTU distribution of fungi in different level of disease in needles of P. densiflora

2.2 真菌物种优势类群组成

对1 683个OTU进行物种归类，归类为28个门、205个属。在门水平上(图3)，子囊菌门(Ascomycota)占比最高，分别达到94.35%、91.85%、91.29%、97.13%，其次为担子菌门(Basidiomycota)，分别占比3.17%、5.68%、2.25%和1.29%，子囊菌门为针叶内生真菌中的优势菌门。在属水平上(图4)，无病斑针叶CC1相对丰度较高的属有多臂菌属(Trichomerium)(5.52%)、暗色球菌属(Phaeococcomyces)(4.25%)、煤炱目的一属(Lapidomyces)(4.03%)、枝孢属(Cladosporium)(3.62%)、煤炱目的一属(Capnobotryella)(2.85%)、小穴壳科的一属(Hormonema)(2.31%)，而染病赤松上的无病斑针叶CC2相对丰度较高的属有暗色球菌属(5.63%)、小穴壳科的一属(Hormonema)(4.87%)、外囊菌属(Taphrina)(4.69%)、煤炱目的一属(Lapidomyces)(4.55%)、链格孢属(Alternaria)(3.84%)、多腔菌属(Myriangium)(3.50%)、煤炱目的一属(Capnobotryella)(3.23%)、枝孢属(2.73%)。在染病较轻针叶CC3中，相对丰度较高的属有星裂盘菌属(Phacidium)(10.31%)、小穴壳科的一属(Hormonema)(7.98%)、截盘多毛孢属(Truncatella)(5.90%)、暗色球菌属(5.89%)、链格孢属(5.51%)、圆盘菌属(Orbilia)(3.66%)、座囊菌科的一属(Rhizosphaera)(3.22%)、煤炱目的一属(Lapidomyces)(3.08%)。而染病较重针叶CC4中属有薄盘菌属(Cenangium)(39.70%)、链格孢属(11.73%)、小穴壳科的一属(Hormonema)(10.62%)、散斑壳属(Lophodermium)(4.70%)、座囊菌科的一属(Rhizosphaera)(2.20%)、截盘多毛孢属(1.83%)、枝孢属(1.58%)。

图3 不同侵染级别下赤松针叶真菌门水平组成Fig.3 Dominant fungal phyla from fungi of different level of disease in needles of P. densiflora

图4 不同感病级别赤松针叶真菌属水平组成Fig.4 Dominant fungal genera from fungi of different level of disease in needles of P. densiflora

2.3 真菌Beta多样性

基于主坐标分析样品间多样性差异，评估不同病级的赤松纯林针叶内生真菌的差异性(图5)，结果表明，第一主坐标PC1与第二主坐标PC2的贡献率分别为33.90%和18.10%，二者累积贡献率为52.00%。无病斑针叶CC1和CC2相聚较近，而发病较轻的CC3和较重的CC4相聚较近，表明在枯梢病侵染的情况下，内生真菌群落结构发生改变，无病斑针叶与染病针叶内生真菌群落构成差异明显。

图5 赤松针叶内生真菌主坐标分析Fig.5 Principal coordinates analysis of fungi in the needles of P. densiflora

2.4 真菌营养型类群

在FUNGuild的分析中，除去未归类的OTU，共有725个OTU在数据库中成功注释了营养型功能信息。在共生营养型的占比上，无病斑针叶CC1中最高(19.76%)，显著高于其他3种针叶(均低于10%)，病理营养型的分布以染病植株上的无病斑针叶CC2(26.37%)与染病较轻的针叶CC3(39.93%)较高，而腐生营养型的占比上，4种针叶内的占比均较高(依次为42.50%、38.00%、37.15%和65.87%)，其中染病较重的针叶CC4最高。真菌群落主要由单一营养型构成，兼顾2种或3种营养型的菌类在4种针叶中占比均较低。

图6 赤松针叶内生真菌群落营养型比较Fig.6 Trophic composition of fungal communities in the needles of P. densiflora

3 讨论

通过高通量测序技术，对纯林内的赤松针叶内生真菌多样性与群落结构进行分析可知，针叶内的真菌多样性丰富，无病斑针叶与染病针叶优势门为子囊菌门和担子菌门，无病斑针叶与染病针叶多样性、群落结构等方面均存在差异。

松枯梢病是针叶树上最常见和分布最广的重要病害之一。国内对松枯梢病的研究在病原菌的多样性、生物学特征等方面均有较大的进展(刘秀嶶等, 2012; 陈洁等, 2019)，此外，近年来通过拮抗菌对病害的控制也取得了较多的成果(蒋萍等, 2007; 王凤各等, 2016)，这些证实了可通过对寄主植物的微生物调控达到防控枯梢病暴发的目的。在其他植物内生微生物的研究中，无病斑植物组织中的内生真菌群落更加稳定，而稳定的群落结构可抑制病原菌的入侵及繁衍。张丽娜等(2011)通过PDA平板培养法比较不同季节内的无病斑山茶(Camelliapitardii)及感病山茶叶片内生真菌群落的差异，发现无病斑叶片的内生真菌数量、多样性、均匀度高于染病叶片，证实染病程度显著影响山茶叶内生真菌多样性。另有研究表明，2个品种染病后的内生真菌变化趋势也不同，高抗品种内生真菌多样性逐渐减少，而高感品种多样性呈现上升的趋势(白维晓等, 2019)。有研究对漆树(Toxicodendronvernicifluum)感染溃疡病的枝干部内生真菌进行培养，比对不同染病情况、不同部位的真菌多样性结果表明，无病斑枝干的内生真菌多样性显著高于受损伤组织，溃疡病菌的侵染对内生真菌群落结构的影响显著(Takemotoetal., 2014)。

本研究中，内生真菌在无病斑针叶中表现为较高的多样性，高于染病针叶，这与先前的研究结论一致。染病较重的针叶中多样性指数显著下降，是因为在针叶的防御体系被破坏后，单一菌种的腐生营养型真菌相对丰度较高的原因。在病原菌入侵植物组织时，寄主植物的防御机制被破坏，内部平衡被打破，其他病原微生物以及腐生微生物更容易进入植物组织内(Steinruckenetal., 2016)。在无病斑棉花(Gossypiumhirsutum)和黄萎病侵染后的棉花根部的内生真菌研究中，黄萎病侵染后的棉花根部内生真菌多样性等指标也均高于无病斑植株根部，证实病原菌的侵染提高了棉花内部微生物的多样性，并影响其群落结构(刘政等, 2016)。

松属树种的针叶内生微生物分析大都通过纯培养法进行研究，对樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、红松(Pinuskoraiensis)等树种的内生真菌或内生细菌进行分离培养，初步证实了松针叶内生微生物的多样性及其中对内生微生物多样性的影响因素，如针叶叶龄(王立祥等, 2016)。在赤松内生真菌研究中(Eoetal., 2018)，分离获得了松生茎点霉菌(Sydowiapolyspora)、勃肯肉齿菌(Sistotremabrinkmannii)、壳针孢属一种菌(Septoriapini-thunbergii)、春孔菌属(Earliellasp.)和散斑壳属菌(Lophodermiumspp.)等多株优势菌株。随着对内生微生物认识的不断提高以及研究水平的提升，第二代测序技术已经常用于微生物多样性的研究中。Bullington等(2015)对针叶树种内生真菌多样性进行了研究，对山白松(Pinusmonticola)针叶进行接种，并通过新一代高通量测序手段对其中的内生真菌多样性和群落结构的变化进行测定，研究内生真菌相互间的种间竞争、共生模式等，证实了接种真菌与潜在病原菌的相互竞争。本研究结果得到内生真菌的优势菌门为子囊菌门。子囊菌门和担子菌门均为常见植物内生真菌(黄彩微等, 2018)，与先前赤松纯培养内生真菌研究(Eoetal., 2018)结论一致。

在无病斑植株的针叶与染病植株上的无病斑针叶的内生真菌群落结构进行对比，发现在染病植株的无病斑针叶群落结构已发生了变化。而在染病较重的针叶中的真菌群落组成中，薄盘菌属为常见的松类病害病原菌，该属被证实与枯梢病病原菌的侵染具有紧密的联系(Luchietal., 2014)。本研究通过群落营养型分析揭示了该种变化，共生型营养菌占比下降，而病理营养型占比增高，其潜伏侵染病原菌的发病率增高。除染病较轻的针叶中病理营养型pathotroph高于腐生营养型，在无病斑与染病针叶中，腐生营养型saprotroph均占有较高的比例，这与无病斑烟草的内生真菌结构一致(李朋发等, 2019)。病理营养型真菌通过伤害寄主细胞来获取自身所需的营养物质，而腐生营养型真菌通过分解死亡的寄主细胞来获取营养物质(Tedersooetal., 2014)。本研究中，染病较轻针叶中的病理营养型真菌占比增高，说明此时针叶中存在较高的致病菌，破坏针叶组织结构，可导致其他类真菌可对针叶进行多重侵染。

4 结论

在赤松纯林中，赤松针叶内生真菌的多样性及群落结构组成受到枯梢病侵染的影响，多样性及丰度均呈下降趋势。无病斑针叶中内生真菌的优势菌属为多臂菌属和暗色球菌属，在染病后群落结构发生改变，无病斑针叶与染病针叶内生真菌群落结构差异显著。腐生营养型真菌在针叶中丰度均较高，共生营养型真菌仅在无病斑植株的针叶上占一定比例，而在染病较轻针叶中病理营养型真菌为主要真菌。