周伊宁，刘宇航，刘卫东，于海泉

(1.内蒙古医科大学，呼和浩特 010100；2.大唐药业股份公司，呼和浩特 010010；3.内蒙古自治区蒙药新药研发企业重点实验室，呼和浩特 010010)

木豆叶为豆科植物木豆Cajanuscajan(L.)Millsp.的干燥叶，夏、秋二季采收，除去枝梗及杂质，晒干。木豆别名观音豆、树豆、三叶豆、野黄豆、山豆根[1]。为世界第六大食用豆类，也是唯一的木本食用豆类。主要分布于东南亚、印度、缅甸及我国云南、四川、江苏、广东、广西和海南等地[2]。木豆叶脂溶性成分主要含芪类及黄酮类化合物[3]，其中，木豆叶提取物中芪类化合物是一类具有广泛药用价值的药物，具有广泛的药理作用，如抗骨质疏松、降血糖、降血脂、胆固醇[4]等，其药效和一线用药相当，而且毒副作用小[2]。

现有木豆叶未列入《中国药典》，仅列入《广东省中药材标准》2004年[1]，但标准很低，未有含量测定项。现有木豆叶含量研究有佟美鸿[5]的高效液相色谱法测定木豆黄酮类物质中牡荆苷、异牡荆苷和荭草苷。郑菲艳等[6]的木豆叶总黄酮含量测定方法。张俊清等[7]的木豆叶中牡荆苷、异美五针松双氢黄酮和木豆芪同时测定的高效液相色谱法。孔羽[8]的首次建立高效液相方法测定木豆叶中木豆素。王惠娟等[9]的木豆叶中木豆多糖测定方法。张俊清等[10]对木豆叶药材质量标准进行了深入研究。上述文献均未见单独测定木豆叶中芪类总量的研究报告。因为木豆叶作为抗骨质疏松的中药材，有明确报道木豆素这类芪类物质发挥主要作用[11,12]，而本课题是通过建立芪类化合物总量测定方法，对木豆叶提取纯化工艺进行评价。根据报道芪类化合物的分子中都含有1,2-二苯乙烯的基本骨架[3]，318nm的吸收是因为其结构上两个苯环通过双键连接起来的长共轭体系的产生，是其特征波长[13]。所以，采用白藜芦醇作为对照品进行，通过测定木豆叶提取物中紫外吸收，建立测定芪类化合物总量方法。

1 仪器与药材

紫外分光光度仪(UV-2450，岛津公司)；万分之一天平(瑞士梅特勒天平公司，型号XPR10)；超声波恒温清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司,SBL-22DT,600W,40KHz)白藜芦醇对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq19022201,纯度≥98%)；木豆叶药材(安国市义通中药材有限公司)，木豆叶药材提取物(内蒙古大唐药业股份有限公司自制)；乙醇(天津市北联精细化学开发公司)为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称定白藜芦醇对照品适量，用乙醇溶解，配成12.8μg/ml，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取木豆叶提取物0.10g，精密称定，置25ml量瓶中，加适量乙醇溶解，超声(20℃、90%)20min，用乙醇定容至刻度，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.3 检测波长的确定

取2.1和2.2项下对照品和供试品溶液，在200～800nm波长范围内扫描，结果见图1。

从图1可见,在紫外区内,白藜芦醇的最大吸收波长为320nm，木豆叶提取物芪类化合物最大吸收波长为318nm。从图谱上看,木豆叶提取物芪类化合物的波峰没有白藜芦醇的波峰尖,经过对木豆叶提取物芪类化合物波峰附近的吸收度进行对比,在318～320nm区间的吸光度差别不大,差别在0.005～0.002之间。综合考虑本试验选定320nm作为测定波长。

因此,以白藜芦醇为标准在320nm测定木豆叶提取物芪类化合物含量。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.1项下白藜芦醇对照品溶液1、2、3、4、5、5.5ml，置10ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320nm下测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，白藜芦醇浓度(μg/ml)为横坐标进行回归，绘制标准曲线，计算回归方程。得y=0.0946x+0.0349，r2=0.9960，见图2，说明白藜芦醇对照品浓度在1.300～7.150μg/ml范围内与吸光度线性关系良好。

2.5 精密度考察

精密吸取2.1项下白藜芦醇对照品溶液4ml，置10ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320nm下测定吸光度，连续测定6次，记录吸光度值，计算RSD。结果表明对照品溶液吸光度的RSD为0.06%(n=6)，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性考察

取同一批次的木豆叶提取物Ⅱ6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320nm下测定吸光度，计算样品中芪类化合物的含量及RSD值。结果表明芪类化合物含量为96.13mg/g，RSD值为2.3%，说明本方法重复性良好。

2.7 稳定性考察

取木豆叶提取物Ⅱ，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，分别于0、30、60、90、120、150、180min在320nm波长处测定吸光度，计算RSD。结果表明供试品吸光度的RSD为1.33%，表明供试品在180min内较稳定。

2.8 加样回收率考察

2.8.1对照品的配制

精密称取白藜芦醇对照品适量，用乙醇溶解配置成13.04μg/ml。

2.8.2供试品的制备

精密称取木豆叶提取物Ⅱ0.10g，置25ml容量瓶中，加适量乙醇溶解，超声(20℃、90%)20min，乙醇定容至刻度，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.8.3加样回收率测定

精密量取2.6项下各供试品溶液0.5ml，置于100ml量瓶中，乙醇定容至刻度，摇匀，在320nm波长处测定吸光度。

分别取对照品溶液15ml和各供试品溶液0.5ml，置于100ml量瓶中，乙醇定容至刻度，摇匀，在320nm波长处测定吸光度。计算加样回收率及RSD值，结果见表1。

表1 芪类化合物含量测定加样回收结果

由表1可知平均加样回收率及RSD分别为101.54%和0.73%。

2.9 含量测定

2.9.1提取物中芪类化合物含量测定

共收集到5批次木豆叶提取物样品。按2.2项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液2ml(木豆叶提取物Ⅱ为精密量取1ml)，置100ml量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320nm下测定吸光度，计算样品中芪类化合物的含量，实验结果见表2。

表2 芪类化合物的含量测定结果

2.9.2木豆叶药材中芪类化合物含量测定

取木豆叶药材1.0g，平行2份，精密称定。分别置具塞锥形瓶中，加25ml乙醇溶解，称定重量，超声(20℃、90%)20min，用乙醇补足失重，滤过，续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加乙醇定容至刻度，摇匀。以相应试剂做空白对照，在320nm下测定吸光度，计算木豆叶药材样品中芪类化合物的含量，实验结果见表3。

表3 木豆叶药材中芪类化合物含量测定结果

3 讨论

芪类化合物的分子中都含有1.2-二苯乙烯的基本骨架，其中2个芳香环上有不同的取代基，常见的取代基是羟基，据报道羟基周围苯环上的H被异戊烯基取代将大大增加该类化合物的生理和药理活性[3]，因此，异戊烯基芪类化合物是近年来研究的热点。木豆叶具有代表性的芪类化合物木豆素、木豆素A、木豆素C，均为具有异戊烯基的芪类化合物，其中，木豆叶芪类提取物具有广泛的药理作用，如抗骨质疏松药理作用等，为本课题的研究重点。

木豆叶提取物为用80%乙醇提取后，再上AB-8大孔树脂，用水及不同浓度乙醇洗脱的提取物，如表1，用新建立的方法，可以定量检测出提取纯化效果。