朱敏 来依宁 高静

【摘要】 目的  探讨miRNA-200s表达改变对EMT的影响。方法  WS诱导体外COPD模型， 分别转染miRNA-200s模拟物或者抑制剂，以转染对照miRNA模拟物为对照组，观测细胞形态学变化，运用免疫组织化学，蛋白印迹以及Real time-PCR检测EMT相关指标的表达改变， 运用Sircold assay检测培养细胞分泌的Col I。结论  WSC诱导EMT现象，miRNA-200c抑制剂促进EMT发生，而miRNA-200c模拟剂则减少EMT发生。

【关键词】miRNA-200s 慢性阻塞性肺疾病（COPD）EMT

【中图分类号】R322.3   【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2020）03-086-01

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以不完全可逆的气流受限为病变特征的疾病【1】。其病因机制复杂多样，仅在最近几年，研究人员已在人肺组织和气道中观察到上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）现象【2。3】。气道上皮细胞可能通过EMT获得间充质细胞表型，并成为成纤维细胞和肌成纤维细胞等促纤维化细胞的重要来源。尤其Sohal和Milara等已经在二手香烟引起COPD病人SAR的样本中发现了EMT的证据。因此，EMT已成为SAR最重要的一个分子机制。本文旨在探究miRNA-200s表达改变对EMT的影响，研究如下：

研究内容、方案及技术路线

（1）研究内容

探究miRNA-200s表达改变对EMT的影响。

（2）实验结果

miRNA-200c表达改变对EMT的影响：WSC刺激培养的16HBE，体外诱导COPD模型，分别进行miRNA-200c的过表达和低表达（分别转染miRNA-200c 模拟物和抑制剂），以control miRNA模拟物为对照。相差显微镜下观察各组细胞的形态学改变，结果显示正常细胞呈典型的上皮细胞形态，经WSC激后，细胞形态明显拉长，由典型的卵石状上皮表型转化成纤维细胞样的间质表型，相邻细胞间连接也变得疏松，呈现EMT状态。加入miRNA-200c抑制剂后，上述现象消失，细胞回归正常上皮细胞状态。当加入miRNA-200c抑制剂时，细胞再次出现EMT现象;蛋白印迹结果显示，经WSC刺激后，SEC23A表达增加，加入miRNA-200c模拟剂可以特异性抑制SEC23A的表达，而使用miRNA-200c抑制剂则促进SEC23A表达明显上调。EMT相关标记蛋白表达结果显示：经WSC激后，细胞上皮型标记蛋白E-cat表达下调，间质型标记蛋白Vimentin表达上调，说明WSC诱导EMT现象，而加入miRNA-200c抑制剂则进一步促进EMT发生，而miRNA-200c 模拟剂则减少EMT发生，促进TME的发生。Sircol soluble collagen assay检测显示：miRNA-200c 模拟剂可降低WSC刺激引起的Collagen I分泌增加，而miRNA-200c抑制剂则促进Collagen I分泌进一步增加。

讨论

EMT的发生与多种蛋白分子，微环境以及MicroRNA等有关，除了常见的诱导因子例如转化生长因子TGF-β等，细胞外基质的主要成分I型胶原（Type I collagen，Col I）也是诱导EMT的重要原因。Col I不仅能诱导胚胎发育中EMT的发生【4】，还可以通过整合素连接激酶依赖性激活NF-kB和淋巴增强因子-1来促进肾脏近曲小管上皮发生EMT【5】，从而在肾纤维化中发挥作用。另有研究小组发现Col1a1基因敲除所导致的EMT异常在小鼠颅面部发育中起着相当重要的作用【6】。体外研究表明，细胞培养在Col I涂层的培养皿中能诱导EMT的发生，而在正常或者其他涂层的培养皿中则没有出现该现象【5，7】。Sun等发现香烟提取物促进气道上皮分泌的生长因子LL-37能激活间充质细胞分泌大量的Col I，成为COPD小气道重塑的重要机制。Zhou等研究发现树木烟雾促进小气道胶原蛋白尤其是Col I沉积，同时有EMT的形成。上述研究结果强烈提示，Col I高分泌，进而导致EMT发生，可能在COPD小气道重塑中起着关键的作用。同時，Sircol soluble collagen assay检测显示：miRNA-200c 模拟剂可降低WSC刺激引起的Collagen I分泌增加，而miRNA-200c抑制剂则促进Collagen I分泌进一步增加。综上研究，miRNA-200c抑制剂促进EMT发生，而miRNA-200c模拟剂则减少EMT发生。

参考文献

[1]Pauwels RA， Buist AS， Calverley PM， Jenkins CR， Hurd SS， on behalf of the GOLD Scientific Committee. Global strategy for the diagnosis， management， and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease （GOLD） workshop summary [Internet]. 2006 [accessed 2005 Jul 16]. Available from： http：//www.goldcopd.org.

[2]Ward C， Forrest IA， Murphy DM， Johnson GE， Robertson H， Caw- ston TE， Fisher AJ， Dark JH， Lordan JL， Kirby JA， Corris PA.Phenotype of airway epithelial cells suggests epithelial to mesenchymal cell transition in clinically stable lung transplant recipients. Thorax 2005， 60： 865–871.

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[6]Lavrin IO， McLean W， Seegmiller RE， Olsen BR， Hay ED. The mechanism of palatal clefting in the Col1a1 mutant mouse. Arch Oral Biol 2001， 46：865–869.

[7]Shintani Y， Hollingsworth MA， Wheelock MJ， Johnson KR. Collagen I promotes metastasis in pancreatic cancer by activating c-jun nh（2）-terminal kinase 1 and up-regulating n-cadherin expression. Cancer Res 2006， 66：11745–11753.

作者簡介：朱敏，出生年月：1978.8，性别：女;民族：汉;籍贯：湖北武汉;职称：主任医师;最高学历：博士;研究方向：呼吸与消化病理及精准医疗

基金项目：该项新疆维吾尔自治区自然科学基金（2016D01A020）