王丹丹，王 鹏

(辽东学院 农学院， 辽宁 丹东 118003 )

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)原名茺蔚，又名益母艾、苦草、九层楼、云母草等，隶属于唇形科(Lamiaceae)益母草属植物。夏季开花其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝经，具有活血调经利水的功能[1]。在世界范围内益母草属植物共有23种，主要分布在亚洲、非洲及美洲各地。中国大部分地区均有分布，共计12种，2个变种，生境较广、适应性强。益母草是中国生药的主要成分，种植益母草已成为部分地区主要的经济产业之一，具有较大的发展前景。然而，种植者在优良品种选育过程中，在采收母本时常常掺杂父本或其它品种，造成益母草种质资源混乱，如同物异名、异物同名、伪品等，严重影响益母草的种质纯度及其真实性，为益母草的育种和种植造成损失[1]。此外，益母草虽为全国遍布种，但因各地生态环境的差异，导致益母草品质有差异，尤其是其生物碱的含量，这严重影响益母草药材质量的稳定性及临床应用效果。当前，制约益母种植产业扩大的主要问题就是杂交种的真实性和种质纯度。然而，中国目前尚未有统一且准确可行的方案用以鉴别益母草种质的真实性和纯度[2]。同时，由于益母草栽培技术还不够成熟，使其规范化栽培和优良品种大面积推广的难度增加。因此，开发益母草优良栽培品种的选育技术势在必行，而采用分子标记技术构建各地益母草DNA指纹图谱，对其新栽培品种的选育、种质纯度的鉴定以及亲缘关系鉴定等方面具有重要意义。

目前，分子标记技术中最常用的是RAPD、AFLP、ISSR等，而EST-SSR(Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeats)分子标记鲜见报道。EST-SSR标记为共显性、不含内含子、扩增条带易识别、且EST来自DNA编码区，是目前鉴别种质真实性和纯度的最佳方法。此外，中国已建立多种植物指纹图谱，如水稻、玉米品种鉴定的DNA指纹图谱等[3-7]，而采用EST-SSR分子标记构建益母草DNA指纹图谱尚未报道。本试验采用采用益母草叶片直接进行PCR扩增，优化了PCR反应体系，采用EST-SSR分子标记技术首次构建10个不同地区益母草栽培品的DNA指纹图谱，为益母草种品种鉴定奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验以不同地区10个常见益母草栽培种为实验材料，分别于春季或夏季，在河北兴隆、广东新兴、四川自贡、云南陆良、江苏宿城、河南南阳、山东东营、福建龙岩、陕西渭南、安徽蚌阜等地选取数枚生长旺盛、健康、幼嫩的叶片置于含有硅胶的自封袋中保存，待用。

1.2 叶片的碱处理

将益母草叶片剪成小于2 mm2的碎片。将各品种健康幼嫩叶片分别放入Eppendorf管中，分别加入40 μL 0.25 mol/L NaOH，煮沸1 min；然后加入40 μL 0.25 mol/L的HCl和20 μL 0.5 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，再次煮沸5 min，最后取出处理后的益母草叶片直接进行PCR扩增反应[8-14]。

1.3 EST-SSR PCR扩增

采用EST-SSR分子标记进行益母草多样性分析，PCR反应体系为20 μL：ddH2O 14 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.5 μL，200 U/mL Taq DNA polymerase 0.5μL，10 μmol/L上下游引物各 1 μL，cDNA模板 2 μL，最后加入经碱处理后的益母草叶片。PCR扩增反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸4 min，35个循环；72 ℃延伸10 min[15-16]。PCR反应产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳分离[17-19]，上海生工生物工程股份有限公司合成该实验用的13对多态性高、稳定性好的核心引物(表1)。

1.4 数据处理

将PCR扩增的数据输入Microsoft Excel，扩增谱带在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳同一平行迁移位置上，有谱带的输入1，无谱带的输入0[20-21]，采用POPGENE version 1.32软件分析观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、遗传分化系数(FST或GST)以及基因流(Nm)(Nm=0.25(1-FST)/FST)等相关参数[22-24]，用以计算分析10个产区益母草栽培品种的遗传多样性，并计算出益母草栽培品种的生物多态信息含量PIC[25-29]；采用ClusterProject软件构建益母草数字指纹图谱，采用MEGA 7.0软件进行10份益母草栽培品的聚类分析，并计算各益母草品种间的遗传距离差异。

2 结果与分析

2.1 EST-SSR引物扩增

采用13对EST-SSR引物分别对10份益母草进行PCR扩增，分析多态性(图1)。据PCR扩增数据显示， 益母草EST-SSR引物共扩增61个等位位点，其中多态性位点高达52个，多态性比率较高(85.2%)。13对EST-SSR引物扩增2～11个等位位点，平均每对引物的基因型为4.69个，谱带大小100～600 bp，基因流(Nm)平均值为1.319(0.190～4.295，表1)，FST平均值为0.180(0.055～0.568，P<0.05，表1)；且13对EST-SSR引物的平均PIC值为0.551(0.452～0.882，表1)，微卫星DNA变异高低程度为多态信息含量(PIC)，其数值代表微卫星DNA多态性高低，而多态性高低取决于等位基因数目和基因频率。说明本研究筛选出的EST-SSR引物具有较高的多态性。

2.2 EST-SSR指纹图谱的构建

不同品种的益母草，使用相同引物所扩增出的条带具有一定的差异性，依据6%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳图谱分析，数据均输入Excel中，同一平行电泳位置上有谱带输入1，无条带则输入0，按照从小到大的顺序排列扩增的谱带，为了方便各品种益母草的谱带对比，在相同竖排对数据进行重新排序，首先分开0和1的品种，并单独提出此排中0或1最少的一组，然后删除第一排电泳数据。以此类推，便可得到存在差异的各种益母草栽培品种采用不同的0或者1数字指纹图谱的形式表示出来，相同的益母草品种其指纹数据完全相同。本文13对EST-SSR核心引物具有区别10种不同益母草品种的能力，其中筛选出5对EST-SSR引物，可完全区分10份益母草品种(表2)，并且该5对EST-SSR引物所扩增的条带清晰、稳定性及多样性均较高，可用于后续遗传多样性分析试验。

表2 益母草品种的DNA数字指纹图谱

2.3 聚类分析

采用MEGA 7.0软件进行聚类分析，构建了10份益母草栽培品种的系统进化树(图2)。聚类分析结果与品种的来源具有较高的一致性，可见，产地较近的益母草品种聚在一个类群中，第Ⅰ类群有6个品种，包括河北兴隆、安徽蚌埠、山东东营、江苏宿城、河南南阳和陕西渭城；第Ⅱ类群包括2个品种，包括四川自贡和云南陆良；第Ⅲ类群有2个品种，即福建龙岩和广东新兴。

3 讨论

本研究所取的10个益母草栽培品种，分布中国不同地区，即河北、安徽、山东、江苏、河南、陕西、四川、云南、福建和广东等地，聚类分析结果表明，在遗传距离0.66处将所有品种分为3类，主要以益母草产地的距离聚类的，比如第Ⅰ类群有6个品种，包括河北兴隆、安徽蚌埠、山东东营、江苏宿城、河南南阳和陕西渭城。依据试验数据分析，在益母草栽培种的选育过程中，导致各地区益母草栽培种群体内部基因流较大的原因(Nm=1.319)，可能由于各地区在杂交选育过程中反复使用相同的授粉系或者不育系造成的，而且10份益母草栽培品种的观测杂合度Ho(0.388)均略低于期望杂合度He(0.647)，上述原因均导致不同产地益母草性状的相似性较高，造成同一地区益母草的遗传基础较窄。为了解决中国益母草品种遗传基础相对狭窄的情况，未来可通过远距离引种，拓宽基因流，在育种方面加强国内外合作，优良品种杂交以及基因工程育种等措施来提高益母草种质资源的优越性。

目前，新品种的特性、品种间的差异以及于新品种的审定，一般采用DUS来鉴定。益母草新品种选育工作，只要达到文件规定条件，便可申请为益母草新品种，并未对提供的样品进行区域试验；而且，目前对于益母草新品种的鉴定仅局限于形态学特征，并未从基因层面上对益母草进行分子鉴定；因此，造成不同地区对同一种益母草误称为不同的名称，而对不同品种益母草视为同一品种的混乱现象，即同物异名和异物同名。本试验采用EST-SSR分子标记技术可以在植物体的不同组织、不同发育时期进行检测，并且不受季节、环境等因素的饰变而对检测结果产生影响；由于EST-SSR分子标记不包括内含子、在基因组中数量较大、多态性较高高、具共显性等特点，即便在形态学上差异很小的两个益母草品种，在遗传基础上只要存在差异，便可通过EST-SSR分子标记进行检测。相比较于其它分子标记技术，EST-SSR还能够鉴别出纯合、杂合的基因型。本试验对取于不同地区的10个益母草栽培品种，采用叶片直接PCR的方法，简化了PCR操作过程，筛选出5对能够鉴定10个益母草栽培品种的EST-SSR核心引物，以此为基础构建出10份益母草栽培品种的DNA指纹数字图谱；解决未来可能发生的品种纠纷问题，同时随着益母草新品种的不断选育，益母草指纹图谱数据库需不断更新，因此便需要不断地筛选出更多的益母草特异性EST-SSR核心引物，以此来保证中国的益母草产业能够稳定有序地健康发展。