郭迎树

(河南中医药大学第一附属医院脑病介入科，郑州 450000)

缺血性脑卒中(cerebral arterial thrombosis)是由于脑动脉狭窄或堵塞、脑组织供血不足而引起的脑组织坏死的疾病总称，包括短暂性脑缺血发作(transient ischemic attack，TIA)、可逆性缺血性神经功能缺失(reversible ischemic neurologicdeficit，RIND)、进展性脑卒中(progressive stroke，PS)、完全性脑卒中(complete stroke，CS)[1-2]。缺血性脑卒中后可因脑组织缺血缺氧，无法供给能量，使钠离子大量内流，细胞膜出现过度去极化，导致脑部癫性放电，引起癫痫发作[3-4]。癫痫(epilepsy，EP)是以脑部神经元异常放电而引起反复痫性发作的慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征。癫痫的长期发作可导致脑部物质发生改变，易引起脑水肿及脑部神经细胞的损害，甚至是神经细胞的死亡[5]。本研究旨在探讨天麻素注射液对大鼠缺血性脑卒中后癫痫发作及神经保护作用的影响，为临床提供参考。

1 材料和方法

1.1 动物

60只健康成年雄性SD大鼠[合格证号：SCXK(沪)20130016]：南京君科生物工程有限公司，SPF级，货号J001，体重(320.43±21.36) g，自由饮食、饮水和活动。

1.2 试剂

氯化锂(美国Amresco公司，货号0416，规格：5 g)；匹罗卡品(美国Sigma公司，货号P650，规格：1G)；地西泮注射液(天津金耀药业有限公司，国药准字H12020957，规格：2 ml*10 mg)；天麻素注射液(昆药集团股份有限公司，国药准字H20013046，规格：2 ml*6支)；0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司，国药准字H20056626，规格：100 ml)；水合氯醛溶液(青岛宇龙海藻有限公司，国药准字H37022673，规格：500 g)；4%多聚甲醛溶液(北京索莱宝科技有限公司，货号P1110，规格：100 ml)；磷酸缓冲盐溶液(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号PB180327，规格：500 ml)；OCT包埋剂(美国Lycra公司，货号4853，规格：118 ml)；牛血清白蛋白(BSA，北京索莱宝科技有限公司，货号A8010，规格：5 g)；2×蛋白上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，货号P1018，规格：10 ml)；1×TBST缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，货号T1085，规格：500 ml)；1×PBST缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，货号P1031，规格：500 ml)；过氧化氢溶液(广东恒建制药有限公司，国药准字H44023919，规格：100 ml)；超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号P0018，规格：500 ml)；BCA蛋白含量测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号P0012S，规格：200次)；兔抗半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine proteinase-3，Caspase-3)多克隆抗体(北京百奥莱博科技有限公司，货号YT691-QRP)；小鼠抗人B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)单克隆抗体(LSBio公司，货号LS-C204627)；兔抗p38多克隆抗体(北京普利莱基因技术有限公司，货号C1811)；小超敏二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号PV-9002，规格：3 ml)；辣根过氧化酶(horseradish，HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)(美国Abbkine公司，货号A21020)；HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(美国Abbkine公司，货号A21010)；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号PA110)；Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号A0516)；Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号A0521)；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记山羊抗兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号A0562)；FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(上海碧云天生物技术有限公司，产品编号A0568)；兔抗神经元特异性核蛋白(neuron specific nucleoprotein，NeuN)IgG(英国Abcam公司，货号ab177487)；小鼠抗NeuN IgG(英国Abcam公司，货号ab104224)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)染色液(美国Sigma公司，货号D9542，规格：5 mg)。

1.3 仪器

96孔板(美国Corning公司，货号2499)；垂直电泳系统(英国Cleaver公司，型号OmniPAGE Maxi)；冰冻切片机(德国Leica公司，型号CM3050S)；匀浆机(瑞士Kinematica公司，型号PT2500E)；酶标仪(北京普天新桥技术有限公司，型号PT-3502G)。

1.4 分组及处理

按照随机数字表法将大鼠分为对照组、缺血性脑卒中后癫痫发作组(模型组)、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组大鼠均为12只，分别编号1～12号。低剂量组给予60 mg/kg天麻素注射液预处理、中剂量组给予90 mg/kg天麻素注射液预处理、高剂量组给予120 mg/kg天麻素注射液预处理，对照组与模型组给予相同剂量的0.9%氯化钠注射液。除对照组外，其余4组给予127 mg/kg氯化锂腹腔注射，18 h后给予30 mg/kg匹罗卡品腹腔注射，对照组给予相同剂量的0.9%氯化钠注射液，此期间严密观察小鼠癫痫发作情况，正常饮食，常规护理，于癫痫发作后2 h给予地西泮注射液终止发作，于癫痫发作3 h后取材。

1.5 大鼠行为学观测

大鼠癫痫发作评价标准(Racine分级)[6]：① 0级：无任何反应。② Ⅰ级：面部阵挛，出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、湿狗样抖动等表现。③ Ⅱ级：Ⅰ级基础上出现节律性点头和(或)甩头。④ Ⅲ级：Ⅱ级基础上出现前肢阵挛。⑤ Ⅳ级：Ⅲ级基础上出现后肢站立。⑥ Ⅴ级：Ⅳ级基础上出现双侧前后肢强直、身体背屈强直、跌倒、持续站立和倾倒、失去平衡、四肢抽动。

1.6 取材

癫痫发作后3 h，10%水合氯醛0.3 g/kg腹腔注射进行麻醉，每组1～6号大鼠给予0.9%氯化钠注射液心脏灌注，直至流出液为澄清液体，快速将大鼠头部切断，取出脑组织，分离大鼠的大脑皮质，匀浆后放置于80 ℃的超低温冰箱中备用，进行免疫印迹试验(Western Blot)。每组7～12号大鼠给予0.9%氯化钠注射液心脏灌注，直至流出液为澄清液体；再用4%多聚甲醛200 ml灌注固定，快速将大鼠头部切断；取出脑组织，将脑组织置于含4%多聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中保存24 h，然后分别在30%、20%、10%蔗糖脱水；脑组织下沉后，置于OCT包埋剂固定，取 15 μm 厚的大脑皮质部位冠状冰冻切片，贴于经多聚赖氨酸处理后的载玻片上，置于20 ℃的冰箱中备用，进行免疫组化染色及免疫荧光染色。

1.7 BCA蛋白浓度测定

将BCA蛋白含量测定试剂盒中的试剂A与试剂B按50∶1的比例混合均匀，至液体颜色变为嫩绿色。用BSA分别配制0、62.5、125、250、500、1000、2000 mg/ml的标准品蛋白，并制作标准曲线。96孔板中每孔均加入200 μl工作液，待测样品20 μl，每孔液体振荡并混合均匀，置于37 ℃水浴锅中反应30 min。利用酶标仪测定每孔吸光度(A562nm)，根据软件计算样品的浓度值及上样量。

1.8 免疫印迹实验

将2×蛋白上样缓冲液加入样品中，煮沸 5 min，然后按照每孔100 μg的蛋白量上样。将标本置于12%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，浓缩胶电压为74 V，分离胶电压为100 V，当标记物接近胶底板时停止电泳。转印至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，恒流转膜，用5%脱脂牛奶进行封闭，室温下置于摇床上摇晃2 h后，按照 1∶1000 的比例加入小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗Caspase-3多克隆抗体和兔抗p38多克隆抗体，4 ℃过夜；次日用1×TBST缓冲液漂洗3次，每次 10 min，按照1∶2000的比例加入相应HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，室温下置于摇床中轻摇孵育1 h；用1×TBST缓冲液漂洗4次，每次15 min，加入超敏ECL化学发光试剂，室温下反应3 min，进行暗室曝光、显影和定影，并扫描条带，运用Image J软件进行分析。

将2×蛋白上样缓冲液加入样品中，煮沸 5 min，然后按照每孔100 μg的蛋白量上样。将标本置于12%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，浓缩胶电压为74 V，分离胶电压为100 V，当标记物接近胶底板时停止电泳。转印至PVDF膜，恒流转膜，用5%脱脂牛奶进行封闭，室温下置于摇床上摇晃2 h后，按照1∶1000的比例加入兔抗p38多克隆抗体，4 ℃过夜；次日用1×TBST缓冲液漂洗3次，每次 10 min，按照1∶2000的比例加入相应HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，室温下置于摇床中轻摇孵育1 h；用1×TBST缓冲液漂洗4次，每次15 min，加入超敏ECL化学发光试剂，室温下反应3 min，进行暗室曝光、显影和定影，并扫描条带，运用Image J软件进行分析。

1.9 免疫组化染色

每组随机抽取一张切片，在PBS溶液中漂洗3次，每次10 min，然后加入0.3%过氧化氢溶液反应10 min，以杀灭内源性过氧化物酶的活性；用1×PBST缓冲液漂洗3次，每次5 min，用10%山羊血清室温下封闭2 h；甩去多余液体，按照1∶1000加入小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体和兔抗Caspase-3多克隆抗体，4 ℃过夜；次日复温30 min后，用1×PBST缓冲液漂洗3次，每次10 min，加入相应HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)和HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，并用小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂盒进行检测，阴性对照用PBS溶液代替一抗；显微镜下控制DAB显色，放入蒸馏水中终止反应，分别用85%、95%、100%的酒精梯度脱水，以二甲苯脱脂和透明，中性树胶封片；在同一条件，利用显微镜观察并拍片，结果运用Image prupro 6.0图像分析系统进行分析；阳性细胞数取3个值的平均值。

1.10 免疫荧光染色

每组随机抽取一张切片，在PBS溶液中漂洗4次，每次10 min，然后用10%山羊血清室温下封闭 2 h；按照1∶1000的比例加入小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体与兔抗NeuN IgG、兔抗Caspase-3多克隆抗体与小鼠抗NeuN IgG孵育2 h；用1×PBST缓冲液漂洗4次，每次10 min，按照1∶2000的比例加入相应的Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L)与FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)、Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)与FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育2 h；用 1×PBST缓冲液漂洗4次，每次10 min，加入超敏ECL化学发光试剂，室温下反应5 min，再用1×PBST缓冲液漂洗3次，每次5 min；在同一条件，利用显微镜观察并拍片，结果运用Image prupro 6.0图像分析系统进行分析。阳性细胞数取3个值的平均值。

1.11 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用配对t检验；计数资料采用χ2检验；有序分类变量资料采用秩和检验。P<0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠行为学观测

对照组无癫痫发作；腹腔注射匹罗卡品后，模型组大鼠5 min后出现泪腺分泌增加、骨骼肌收缩等胆碱能兴奋反应，且低剂量组发作潜伏期[(28.64±4.75) min]、中剂量组发作潜伏期[(32.25±5.21) min]及高剂量组发作潜伏期[(29.36±4.52) min]具有统计学差异(P<0.05)。

2.2 大鼠大脑皮质中Bcl-2与Caspase-3含量

癫痫发作72 h后，模型组大鼠大脑皮质中Bcl-2含量高于对照组，具有统计学差异(P<0.05)；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Bcl-2含量高于模型组，Caspase-3含量低于模型组，具有统计学差异(P<0.05)。见图1。

A：对照组；B：模型组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组图1 大鼠大脑皮质中Bcl-2与Caspase-3含量

2.3 大鼠大脑皮质中Bcl-2与Caspase-3阳性神经元数量

低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Bcl-2阳性神经元数量高于模型组，且中剂量组高于低剂量组、高剂量组，具有统计学差异(P<0.05)；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Caspase-3阳性神经元数量低于模型组，且中剂量组低于低剂量组、高剂量组，具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠大脑皮层中Bcl-2与Caspase-3阳性神经元数量 个/mm2

2.4 大鼠大脑皮质中Bcl-2与Caspase-3阳性细胞数

低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Bcl-2表达高于模型组，且中剂量组高于低剂量组、高剂量组，具有统计学差异(P<0.05)；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Caspase-3表达低于模型组，且中剂量组低于低剂量组、高剂量组，具有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 大鼠大脑皮质中Bcl-2与Caspase-3阳性细胞数 个/mm2

2.5 天麻素注射液对大鼠大脑皮质中p38的影响

模型组大鼠大脑皮质中p38活性高于对照组，具有统计学差异(P<0.05)；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中p38活性低于模型组，具有统计学差异(P<0.05)。见图2。

A：对照组；B：模型组；C：低剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组图2 大鼠大脑皮质中p38活性变化

3 讨论

缺血性脑卒中是临床上常见的脑外科疾病，随着人口老龄化的进展，缺血性脑卒中的发病率呈逐年上升趋势[7]。癫痫病因较为复杂，主要分为三类，包括特发性癫痫、症状性癫痫和隐源性癫痫[8-9]。有研究表明[10]，缺血性脑卒中后癫痫发作存在两个高峰期，即缺血性脑卒中后24 h和梗死后6个月～1年内。目前，癫痫主要以药物治疗为主。有研究表明[11]，仍有10%～15%的患者对药物治疗不敏感，需要进行外科治疗。

天麻属多年生草本植物，根茎入药可治疗头晕、肢体麻木及小儿惊厥等，与灵芝合用可治疗头痛、失眠。天麻素为天麻的有效成分，具有较高的药用价值[12-13]。p38蛋白激酶属应激激活的蛋白激酶，主要存在于腺体组织。与体内凋亡启动、细胞周期静止有密切关系，p38蛋白激酶对于不同肿瘤细胞作用不同[14]。有研究表明[15]，天麻素通过下调大鼠大脑皮质中p38活性，减轻由兴奋性氨基酸(excitatory amino acids，EAA)对神经系统引起的兴奋性毒性作用。本研究表明，模型组大鼠大脑皮质中p38活性高于对照组；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中p38活性低于模型组，说明天麻素对p38蛋白激酶具有调控作用，使大鼠体内p38水平下调。

Bcl-2是一种原癌基因，可抑制由多种细胞毒因素引起的细胞死亡。体内Bcl-2的过度表达可增强细胞对细胞毒素的抵抗力。Caspase-3是一种蛋白酶，为细胞凋亡中主要的终末剪切酶，并且为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte, CTL)杀伤机制的重要组成部分[16]。Caspase-3底物中最重要的底物为多聚ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase，PARP)。PARP与DNA结合的锌指结构(zinc finger)与羧基端的催化区域分离，使体内钙/镁依赖性核酸内切酶(endonuclease)活性增高，裂解核小体(nucleosome)间的DNA，引起细胞凋亡[17]。本研究结果显示，低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Bcl-2阳性神经元数量高于模型组，且中剂量组高于低剂量组、高剂量组；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Caspase-3阳性神经元数量低于模型组，且中剂量组低于低剂量组、高剂量组；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Bcl-2表达高于模型组，且中剂量组高于低剂量组、高剂量组；低剂量组、中剂量组及高剂量组大鼠大脑皮质中Caspase-3表达低于模型组，且中剂量组低于低剂量组、高剂量组，说明天麻素可增加癫痫发作大鼠大脑皮质中Bcl-2蛋白表达，并降低Caspase-3蛋白表达，抑制体内癫痫凋亡的发生，具有保护大脑的作用。

综上，天麻素注射液可抑制缺血性脑卒中癫痫发作大鼠大脑皮质中促凋亡因子水平，增加抗凋亡因子水平，且可降低体内p38蛋白激酶水平，具有保护脑部神经作用，安全性较好，具有临床参考价值。