王雪松 张素敏 隋韶奕 李珂

摘要：黑果腺肋花楸果实兼具营养价值和保健功能。采用乙醇回流提取法提取黑果腺肋花楸有效成分，以总黄酮含量为考察指标，通过正交试验优化工艺参数。结果表明：黑果腺肋花楸果实有效成分最佳提取工艺为加10倍量的65%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h。

关键词：黑果腺肋花楸;有效成分;总黄酮;提取工艺;优化

中图分类号：TS255.3    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2020）05-0049-03

黑果腺肋花楸俗称不老莓，为多年生蔷薇科灌木，其果实为黑色浆果，营养极为丰富，含多种蛋白质、碳水化合物、维生素等营养成分，同时含有黄酮、多酚、多糖等功能性成分，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗癌、消炎止痛等功效。黑果腺肋花楸中脂溶性成分为其有效成分，以总黄酮含量为考察指标。有效提取总黄酮是开发黑果腺肋花楸产品的关键工艺。本课题采用乙醇回流提取法，通过正交试验研究黑果腺肋花楸果实有效成分的最佳提取工艺，旨在为黑果腺肋花楸产品工业生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸：辽宁岭秀山矿泉饮品有限公司。芦丁标准品：中国药品生物制品检定所，批号20100206;乙醇：北京化工厂;硝酸铝：中国惠世生化试剂有限公司;亚硝酸钠：国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠：北京化工厂。

1.2 仪器设备

电热恒温水浴锅：北京科伟永鑫实验仪器设备厂;分析天平：德国赛多利斯集团;超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司;DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司;DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;RE-52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂;UV-2550型紫外可见分光光度计：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 分光光度法测定乙醇提取物中总黄酮含量 1） 标准品溶液的制备。取芦丁标准品约2.060 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入适量乙醇，超声处理使其溶解，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，制成0.206 mg/mL的芦丁标准品溶液。2） 供试品溶液的制备。将黑果腺肋花楸干果粉碎后取样品0.030 g，置于25 mL量瓶中，加入浓度为50%的乙醇溶液25 mL，超声处理使其溶解，放冷，过滤，收集续滤液。3） 最大吸收波长的确定。配制芦丁标准品溶液，以相应试剂作空白，在400～700 nm波长范围内进行扫描。扫描图谱如图1所示，对照品溶液在505 nm波长处有最大吸收峰。4） 供试品溶液的测定。精密移取供试品溶液4 mL置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，摇匀，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加入氢氧化钠试液5 mL，加去离子水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂作空白，在505 nm波长处测定吸光度值。

1.3.2 正交试验设计 以预试验结果为基础，选择乙醇浓度（A）、加醇量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，以总黄酮含量为考察指标，进行L9（34）正交试验，因素水平设计见表1。按表1中设计条件进行乙醇回流提取，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.22～1.25（60 ℃）的稠膏。

2 结果与分析

2.1 乙醇提取物中总黄酮含量分析

2.1.1 线性关系结果 分别精密量取芦丁标准品溶液2，3，4，5，6 mL，置于25 mL量瓶中，以相应试剂作空白，在波长505 nm處测定吸光度值，以总黄酮浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线（如图2所示），求得回归方程为Y=0.011 3X-0.004 0，相关系数r=0.999 6，总黄酮浓度在24.336～56.784

μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.1.2 中间精密度试验 由不同时间、不同人员利用不同仪器检测供试品溶液。分别取两批平行样品3份，制备供试品溶液，进行测定，结果见表2。

由表2可知：RSD为1.57%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性试验 取同一批样品6份，制备供试品溶液，进行测定，结果见表3。

由表3可知：RSD为0.84%，表明含量测定重复性良好。

2.1.4 稳定性试验 取供试品溶液在室温下分别放置0，10，20，30，40，50 min，进行测定，结果见表4。

由表4可知：RSD为1.55%，表明供试品溶液至少在50 min内稳定。

2.1.5 回收率试验 精密吸取已知总黄酮含量的供试品溶液6份，分别精密加入0.085 mg芦丁对照品溶液，进行测定，结果见表5。

由表5可知：平均回收率为100.19%，表明此方法可行。

2.2 正交试验结果

黑果腺肋花楸有效成分提取正交试验结果见表6，方差分析结果见表7。

由表6和表7可知：以总黄酮含量为考察指标，各因素对乙醇回流提取工艺的影响顺序为提取次数>乙醇浓度>加醇倍量>提取时间，其中乙醇浓度和提取次数的影响有显著性差异。综合考虑选用常规方案，最佳工艺为A2B2C1D2，即：加10倍量的65%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h。

2.3 验证试验结果

按照正交试验结果优选出的最佳工艺条件A2B2C1D2进行重复性试验，结果见表8。

由表8可知：RSD为1.96%，表明该工艺稳定可行。

3 结论

试验结果表明：影响乙醇回流提取工艺的各因素作用顺序为提取次数>乙醇浓度>加醇倍量>提取时间，其中乙醇浓度和提取次数的影响有显著性差异;通过对总黄酮含量的测定，确定最佳提取工艺为A2B2C1D2，即加10倍量的65%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h;验证试验得到RSD为1.96%，说明该工艺简便、易行、稳定。有效成分提取工艺优化结果可为黑果腺肋花楸的功能性研究与应用提供参考。

参考文献

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