郭洪壮，胡月明，王辉，涂宗财,2,3*

1(南昌大学，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)2(江西师范大学，国家淡水鱼加工技术研发专业中心，江西 南昌，330022)3(江西师范大学，江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心，江西 南昌，330022)

CompositionofcalciuminthebonesoffourmajorChinesecarps

GUO Hongzhuang1,HU Yueming1,WANG Hui1,TU Zongcai1,2,3*

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)2 (National R&D Center for Freshwater Fish Processing (Nanchang), Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)3(Engineering Research Center for Freshwater Fish High-value Utilization of Jiangxi Province, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Keywordsfour major Chinese carps; Raman spectroscopy; X-ray photoelectron spectroscopy; X-ray diffraction; the composition of fish bone calcium

我国是世界淡水渔业大国，青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼作为传统“四大家鱼”，养殖历史十分悠久，其产量一直位居前列，直到今天，仍然是我国淡水鱼类养殖的主体鱼类[1]。2017年全国淡水鱼类养殖产量2 540.98万t，其中草鱼、鲢鱼、鳙鱼位居前三[2]，青鱼虽产量较低，但因其口感优良，也深受消费者喜爱。

鱼骨是鱼体中轴骨(头骨和脊骨)、附肢骨(奇鳍骨和偶鳍骨)和鱼刺的总称[3]，占鱼体总质量的10%～15%[4]，在鱼体中主要起支撑与保护功能。作为鱼类加工过程中产生的下脚料之一，鱼骨常被当成加工废料处理，随意倾倒和掩埋，严重污染环境，或者用作生产饲料和肥料，经济效益很低。因此为了提高鱼骨的利用价值，在食品工业中，鱼骨常被加工成各种补钙产品，如活性钙[5]、螯合钙[6]等，但是鱼骨钙的组成形式尚未探究清楚，研究者们一般将其简单定义为羟基磷灰石，更为详细的组成形式鲜见报道。前人报道，人骨中的钙盐主要以结晶的磷灰石(60%)和无定形的CaHPO4(40%)形式存在[7]，而鱼骨的钙盐还未有这样的探索。“四大家鱼”鱼骨是重要的高值化加工原料，不同鱼骨钙的组成形式对其加工利用存在一定的影响，例如酸法是最常用的利用鱼骨钙的方法，而在1个标准大气压、25 ℃下，CaHPO4的溶解度约是Ca3(PO4)2的68倍[8]，其与酸反应的速率与产物也不一致。

因此，本文以“四大家鱼”鱼骨为原料，通过红外光谱、扫描电镜、拉曼光谱、X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)等手段，结合光谱学、食品学、材料学等方向内容对其鱼骨钙的组成形式进行研究，以期能够详细分析出“四大家鱼”鱼骨钙的组成形式，为鱼骨钙的综合利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼各3条，江西省南昌市江大南路菜市场，体重规格均为2～3 kg，取其脊骨；氯仿、H2O2、无水乙醇(分析纯)，西陇科学股份有限公司；甲醇(分析纯)，国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪，美国热电尼高力公司；JSM 6701F型场发射扫描电镜带能谱仪，日本电子公司；ESCALAB250Xi型X射线光电子能谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；LabRAM HR型激光拉曼光谱仪，法国Jobin Yvon公司；D8 Advance型X射线衍射仪，德国Bruker公司；SXL-1002型程控箱式电炉,上海精宏实验设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 红外光谱

鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1溶液中完全浸没6 h，再经超纯水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。采用压片法对鱼骨粉进行红外光谱分析，取适量鱼骨粉与KBr共同压片，放入红外光谱仪测量，测量参数为仪器分辨率4 cm-1、扫描累加32次、扫描范围4 000～400 cm-1。

1.3.2 扫描电镜

鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸没6 h，再用体积分数为30%的H2O2浸泡48 h，使用双蒸水于超声机内清洗2 h，无水乙醇脱水，真空冷冻干燥，取若干颗粒喷金后放入扫描电镜观察。

1.3.3 XPS

鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸没6 h，再经超纯水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。将适量鱼骨粉放入样品台正中间，用X射线光电子能谱仪测量，测量参数为源枪类型Al靶(1 486.6 eV)、光斑650 μm、 扫描步长0.100 eV，结果用XPSPEAK41软件分析。

1.3.4 拉曼光谱

鱼骨初步破碎后于V(氯仿)∶V(甲醇溶液)=1∶1中完全浸没6 h，再经超纯水清洗，60 ℃烘箱中烘干12 h，研磨成粉。将适量鱼骨粉放在样品室内，用拉曼光谱仪测量，测量参数为激发波长632.8 nm、光谱仪焦长800 mm、扫描频移范围300～3 500 cm-1，结果用PeakFit v4.12软件(Systat 公司，美国)分析。

1.3.5 XRD

鱼骨经900 ℃灰化8 h后研磨成粉。将适量鱼骨粉放入样品台正中间，用X射线衍射仪测量，测量参数为光源Cu-Kα(λ=1.540 56 nm)、检测电压40 kV、电流80 mA、扫描角度5°～80°、扫描步长2 °/s，结果用X′Pert HighScore Plus软件(帕纳科公司，荷兰)分析。

1.3.6 数据处理

同种鱼的3条鱼骨作为3个平行，所有实验均重复3次；文中需要绘制的图均使用Originpro 8.0软件进行绘制；数据利用SPSS 17.0软件(SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA)中的Duncan’s test进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析

图1 四种鱼骨的红外光谱图Fig.1 Infrared spectra of four kinds of fish bones

2.2 扫描电镜分析

鱼骨经过脱脂、脱蛋白处理后，通过扫描电镜可以看到骨中钙盐的形貌，结果如图2所示。首先可以看到鲢鱼骨上出现了许多孔洞，这可能是因为鲢鱼骨中胶原蛋白含量比较高[10]，与钙盐结合的较多，胶原蛋白被过氧化氢脱去形成孔洞。另外4种鱼骨的钙盐都存在多种形貌，前人报道骨中不同类型钙盐的形貌是不同的，以羟基磷灰石为代表的晶体钙盐多以片状形式存在[11]，非晶体钙盐多以无定形的CaHPO4形式存在，这说明4种鱼骨的钙都可能以羟基磷灰石与无定形的CaHPO4的形式存在。

1-青鱼；2-草鱼；3-鲢鱼；4-鳙鱼；a-放大100倍；b-放大500倍；c-放大1 000倍图2 四种鱼骨的扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscope of four kinds of fish bones

2.3 XPS分析

XPS可以根据谱图中各种元素的特征峰位，确定鱼骨中各种元素的化学价态。图3为4种鱼骨的XPS全谱扫描图。通过4种鱼骨Ca、O、P的特征峰位，Ca 2p特征峰处于350.6与347.0 eV，O 1s特征峰处于531.0 eV，P 2p特征峰处于133.0 eV附近，可以确定4种鱼骨中Ca，O，P的价态分别为+2，-2和+5价[12]，磷酸盐以正磷酸盐的形式存在。

图3 四种鱼骨的XPS全谱扫描图Fig.3 XPS full-spectrum scanning images of four kinds of fish bones

通过对4种鱼骨XPS谱图上Ca、P的特征峰进行拟合分析，利用其峰面积进行计算，可以得出4种鱼骨的Ca、P两种元素原子数的比值(Ca/P)，结果如表1所示。已知纯羟基磷灰石中Ca/P约为1.67，4种鱼骨的Ca/P都比1.67小，依次为青鱼骨1.40、草鱼骨1.38、鲢鱼骨1.25、鳙鱼骨1.27，这说明4种鱼骨中都存在一定量的无定形CaHPO4，致使P元素原子数增多，Ca/P减小。

表1 四种鱼骨钙的Ca/P的比较Table 1 Comparison of Ca/P of four kinds of fish bones

经过对Ca进行窄谱扫描、荷电校正后得出4种鱼骨Ca的精确峰位。4种鱼骨Ca的峰位与峰间距存在一定的差异，其中草鱼骨与其他3种鱼骨的差异最为显著，其峰位出现在347.05和350.70 eV处，均大于其他3种鱼骨(图4)。通常当被测原子与电负性大的原子结合时，其原子核外电子云密度会减小，会导致其XPS峰向高结合能方向位移[13]。草鱼骨峰位出现了整体向高结合能方向移动的情况，可能是由于相比其他3种鱼骨，草鱼骨Ca存在的形式是不同的，羟基磷灰石OH-发生更多的F-取代，晶格畸变更明显。

图4 四种鱼骨Ca的XPS窄谱扫描图Fig.4 XPS Narrow Spectra of Ca of four kinds of fish bones

2.4 拉曼光谱分析

a-原始数据；b-处理图图5 四种鱼骨的拉曼光谱及部分处理图Fig.5 Raman spectra and partial treatment diagrams of four kinds of fish bones

表2 四种鱼骨的比值与矿物结晶度的比较Table 2 Comparison of and mineral crystallinity of four kinds of fish bones

磷灰石是晶体，但骨中钙也会以非晶体的无定形CaHPO4的形式存在[17]，矿物结晶度一定程度上可以代表磷灰石的含量，结果为青鱼>草鱼>鳙鱼>鲢鱼。

青鱼骨与草鱼骨的无定形CaHPO4质量分数接近40%，与成人骨较为接近，而鲢鱼骨与鳙鱼骨的无定形CaHPO4质量分数超过了60%，比人骨要高；磷灰石的含量是羟基磷灰石与碳酸磷灰石含量的加和，结果为青鱼>草鱼>鳙鱼>鲢鱼，该结果与拉曼光谱的结晶度数据一致；人骨中碳酸磷灰石质量分数在4%～8%[19]，而4种鱼骨的碳酸磷灰石含量都超出许多，这可能与其生活习性有关。碳酸磷灰石与无定形CaHPO4的溶解度比羟基磷灰石要高，易被酸溶解，所以提取酸溶性钙或熬制骨汤，鲢鱼骨和鳙鱼骨更为合适。

表3 四种鱼骨的羟基磷灰石、碳酸磷灰石、无定形CaHPO4质量分数的比较 单位：%

2.5 XRD分析

灰化后的青鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼骨寻出了相同的物相，只是含量有所不同。草鱼骨中寻出了含量较多的硒磷灰石，含量较少的氯磷灰石，且羟基磷灰石含量最低，氟磷灰石含量最高，这与XPS的分析结果是基本一致的。草鱼肉中含有硒元素，部分沉积到骨钙中，提高了骨的硒含量，但氟元素含量比较高，一定量的氟会带来许多病痛，大量的氟甚至会导致人中毒[21]，因此相比其他3种鱼骨，对草鱼骨的利用要慎重。

图6 四种鱼骨的XRD图Fig.6 XRD patterns of four kinds of fish bones

表4 四种鱼骨的磷灰石物相及各自质量分数的比较单位：%

羟基磷灰石由于具有独特的生物相容性、骨传导性和诱导性，被广泛应用于各种生物医学材料中，鱼骨为原料生产的羟基磷灰石纯度较好、成本低廉，且研究者们对其进行细胞毒性实验发现无明显毒性[22]。因此鱼骨中的钙不仅可以加工成补钙产品，而且可以用作生产羟基磷灰石。

磷灰石在骨中以六方晶系的结构存在，经过搜索晶胞与修正晶胞后，得到4种鱼骨的晶胞参数。其中青鱼骨晶胞参数a=b=0.941 5 nm、c=0.686 9 nm、V=0.527 368 nm3；草鱼骨a=b=0.940 5 nm、c=0.685 7 nm、V=0.525 309 nm3；鲢鱼骨a=b=0.941 6 nm、c=0.687 6 nm、V=0.528 009 nm3；鳙鱼骨a=b=0.941 5 nm、c=0.687 2 nm、V=0.527 527 nm3，可以看出,4种鱼骨的晶胞参数大小是鲢鱼>鳙鱼>青鱼>草鱼，这可能与F-的取代有关，F-比OH-的体积要小，当F-取代OH-时会使晶胞参数变小。本文参考的标准卡片01-084-1 998显示纯的羟基磷灰石的晶胞参数为a=b=0.941 7 nm、c=0.687 6 nm、V=0.527 910 nm3，与青鱼、鲢鱼、鳙鱼骨灰化后的晶胞参数较为接近，因此这3种鱼骨灰化得到的羟基磷灰石纯度较高，可以作为一种优质的羟基磷灰石加工原料。

3 结论

本文创新性的利用多组光谱和扫描电镜数据，结合光谱学、食品学、材料学等方向内容，构建了一种分析“四大家鱼”鱼骨钙组成形式的方法。该方法简便、快速、准确度高，能较详细地分析出样品的骨钙组成形式，为鱼骨钙的综合利用提供更多的科学依据，也为研究其他物种的骨钙组成形式提供一定的参考。

青鱼骨与草鱼骨的无定形CaHPO4质量分数接近40%，与成人骨较为接近，而鲢鱼骨与鳙鱼骨的无定形CaHPO4质量分数均超过了60%，比人骨要高；4种鱼骨的碳酸磷灰石含量都比人骨超出许多。根据碳酸磷灰石与无定形CaHPO4的含量，得出鲢鱼骨和鳙鱼骨更为适合提取酸溶性钙或家用熬制骨汤。草鱼骨不仅含有硒，也有许多氟，因此相比其他3种鱼骨，草鱼骨的利用要慎重。青鱼、鲢鱼、鳙鱼骨灰化后的晶胞参数与纯羟基磷灰石更为接近，因此这3种鱼骨可以作为一种优质的羟基磷灰石加工原料。这些结果可以为“四大家鱼”鱼骨钙的综合利用提供一定的理论依据。