向冬梅 易思宇 唐青海

摘要：为了得到较优的卵黄抗体提取工艺，试验改良了辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法与聚乙二醇沉淀法5种提取方法。IPGT诱导表达重组猪致病性大肠杆菌（Escherichia coli）毒素STxB蛋白（rSTxB），与佐剂71VG乳化制备免疫原免疫蛋鸡，利用改良的聚乙二醇沉淀法提取高免卵黄抗体，采用SDS-PAGE电泳检测抗体纯度，通过Western blot检测卵黄抗体和血清抗体效价。结果表明，辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法提取效率分别为96.00、81.99、155.50、65.34、46.00 mg/mL，其中聚乙二醇沉淀法的提取纯度最高。重组STxB蛋白分子量大小约25 kDa，血清中抗体效价最高达到64 000倍，卵黄抗体最高稀释倍数为16 000倍。综合评估，聚乙二醇的提取法相对较优，且提取的卵黄抗体具有良好的免疫活性。

关键词：卵黄抗体;提取工艺;聚乙二醇沉淀法;STxB蛋白;佐剂

中图分类号：S852.4+3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）15-0108-06

Abstract： In order to obtain a relatively good extraction process of egg yolk antibody， five methods including octanoic acid method， water dilution method， chloroform method， ammonium sulfate precipitation method and polyethylene glycol precipitation method were improved in this experiment. Expression of recombinant porcine pathogenic Escherichia coli toxin STxB（rSTxB） was induced by IPGT， and then the immunogen was prepared by emulsifying the rSTxB with the adjuvant 71VG， and the hens were immunized， IgY was extracted by modified polyethylene glycol method. The purity of the IgY antibody was detected by SDS-PAGE electrophoresis， and the immunoactivity and titers of yolk antibody and serum antibody titer were detected by Western blot. The results showed that the extraction efficiencies of octanoic acid method， water dilution method， chloroform method， ammonium sulfate precipitation method and polyethylene glycol precipitation method were 96.00，81.99，155.50，65.34，46.00 mg/mL，respectively， and the extraction purity of polyethylene glycol precipitation was the highest. The molecular weight of rSTxB protein was about 25 kDa， the antibody titer in serum was up to 64 000 times， and the highest dilution factor of yolk antibody was 16 000 times. For the comprehensive evaluation， the extraction method of polyethylene glycol precipitation was relatively superior， and the extracted yolk antibody showed good immunological activity.

Key words： egg yolk antibody; extraction process; polyethylene glycol precipitation; STxB protein; adjuvant

卵黃抗体（IgY）是鸡卵黄中的一种免疫球蛋白，属γ球蛋白，其分子结构由二硫键连接的2条相同的重链（分子质量约66 kDa）和2条相同的轻链（分子质量约25 kDa）组成[1]。IgY在动物促生长、疾病诊断、预防和治疗中有广泛应用。马蕾等[2]采用腹腔注射非微囊化的胆囊收缩素（Cholecystokinin， CCK）的特异IgY能明显地促进动物生长。张晓萍[3]用鸡作生物反应器大量生产抗生长抑制素IgY可提高其生产性能。有报道称IgY可有效识别大分子蛋白毒素，起到降低毒素毒性的作用[4]。Wang等[5]研究显示抗致病性大肠杆菌毒素Stx1的特异性IgY可有效阻断Stx1与Hela细胞的结合，并可保护小鼠免受毒素攻击。王荣[6]的研究表明IgY可阻断产肠毒素大肠杆菌（ETEC）对宿主从肠上皮细胞的粘附。Neri等[7]针对志贺毒素（Stxs）的各种毒素中和剂研究显示口服抗Stx-2 IgY可降低ETEC O157∶H7肠道感染小鼠的死亡率。Mine等[8]报道了口服IgY可成功治疗多种胃肠道感染，如牛和人轮状病毒、牛冠状病毒、产肠毒素大肠杆菌、沙门氏菌等。诸多报道称IgY在检测疾病诊断、预防和治疗方面具有稳定性好、特异性高和灵敏度高、安全无毒、无残留、不产生抗药性、能增强机体免疫力等优点[9， 10]，且可作为注射剂、口服剂或饲料添加剂用于预防和治疗[11]。中国农业农村部已明确发文，规定到2020年饲料中将全面禁止添加抗生素，IgY是一种较为理想的抗生素替代品。

IgY提纯的关键在于脂质的去除。据报道IgY提取工艺主要有沉淀法、层析法、超滤法、抽提法和反复冻融法，沉淀法又分为盐析沉淀、有机溶剂沉淀和有机聚合物沉淀，沉淀法简单经济但是IgY纯度低;层析法纯度高但是产率低且费用高;超滤法纯度高但是生产成本高不适用于工业化生产;抽提法产率较高但残留对环境有害;而冻融法回收率低[12， 13]。为此，本研究改良并比较了IgY提取的辛酸法、水稀释法、氯仿法、硫酸铵沉淀法和聚乙二醇沉淀法，制备重组STxB蛋白作为抗原免疫蛋鸡，诱导产生特异性的IgY，通过综合评估提取效率、纯度和抗体的效价与免疫活性，得到相对较优的IgY提取工艺，为IgY工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

聚乙二醇（PEG-6000）、硫酸铵、辛酸、考马斯亮蓝等分析纯化学试剂均购自Solarbio公司;IPTG为宝日医生物技术（北京）有限公司产品;MONTANIDETM ISA71VG佐剂为SEPPIC公司产品;DAB显色试剂盒为北京中杉金桥公司产品;Mouse anti-His单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗和HRP标记的羊抗鸡二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司;PVDF膜为Millipore产品;表达志贺氏毒素的表达菌株BL21（DE3）-pET28a-STxB由衡阳师范学院畜禽养殖生物工程技术研究所构建保存。

1.2 方法

1.2.1 卵黄抗体的5种提取工艺 收集160日产蛋高峰期的商品蛋（产蛋鸡按照蛋鸡常规免疫程序作了相应的免疫），鸡蛋洗净后用70%的酒精擦拭消毒。分离卵黄，充分搅拌均匀，取卵黄原液分别按以下5种方法提取卵黄抗体。

1）辛酸法（Caprylic acid，CA）。根据吴博等[14]的试验方法加以改良，具体如下。按照1∶4的体积比在1份卵黄原液中加入4份体积0.06 mol/L的乙酸缓冲液（pH 4.0），用5 mol/L的NaOH调节pH至4.5;每毫升卵黄液加入25 μL辛酸，混匀，室温作用30 min。10 000 r/min离心10 min，取上清液，加入10倍体积的PBS缓冲液（pH 7.4），用5 mol/L的NaOH调节pH至7.2～7.4，每毫升溶液中加入0.227 g硫酸铵，搅拌溶解，4 ℃放置1 h。4 ℃下10 000 r/min离心30 min，弃去上清液，沉淀物中加入浓度为14%的硫酸铵溶液。4 ℃下10 000 r/min离心30 min，去掉上清液，沉淀称重并加入PBS（pH 7.4）溶液溶解（每10 mL卵黄原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

2）水稀释法（Water dilution，WD）。根据Ren等[15]的试验方法进行改进，具体如下。按照1∶9的体积比在1份卵黄液中加入9份体积的去离子水，搅拌均匀;用1 mol/L HCl调节卵黄液pH为5.0～5.2。4 ℃下10 000 r/min离心25 min，取上清液，再加入19%（W/V）的硫酸钠，充分搅拌溶解后，室温放置    2 h。4 ℃下10 000 r/min离心25 min，弃上清，沉淀称重，在沉淀物中加入PBS（pH 7.4）溶解（每10 mL卵黄原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

3）氯仿法（Chloroform，CF）。根據刘瑞生等[13]的试验方法进行改进，具体如下。按照1∶9的体积比在1份卵黄液中加入3份体积的PBS缓冲液（pH 7.5），混合均匀，加入等体积的氯仿，充分混匀。4 ℃下10 000 r/min离心30 min，抽取水相层，再加入12%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6000），搅拌均匀，室温下作用30 min。4 ℃下10 000 r/min离心30 min，弃上清液，沉淀称重，在沉淀物加入PBS（pH 7.4）溶解（每10 mL卵黄原液用1 mL PBS溶液溶解），  -20 ℃保存。

4）硫酸铵沉淀法（Ammonium sulfate precipitation，AS）。根据蒋兴龙等[16]的试验方法进行改进，具体如下。按照1∶9的体积比在1份卵黄液中加入9份体积的去离子水稀释，充分搅拌均匀;用0.1 mol/L HCl 调节卵黄液pH为5.0～5.2，充分搅拌均匀，4 ℃静置过夜，至脂类分层。4 ℃下12 000 r/min离心30 min，收集上清;然后在上清液中加入硫酸铵，至终浓度为20%（W/V）， 充分搅拌溶解后，室温静置1 h。4 ℃下12 000 r/min离心30 min，弃掉上清，往沉淀中加入PBS（pH 7.4）溶液15 mL悬浮溶解沉淀;再加入硫酸铵，至终浓度为14%（W/V），充分搅拌溶解后，室温下静置1 h。4 ℃下12 000 r/min离心30 min，弃上清液，沉淀称重，在沉淀物加入PBS（pH 7.4）溶液溶解（每10 mL卵黄原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

5）聚乙二醇沉淀法（Polyethylene glycol precipitation，PEG）。根据Pauly等[17]的试验方法进行改进，具体如下。按照1∶2的体积比在1份卵黄液中加入2份体积的PBS缓冲液（pH 7.5），剧烈振荡  30 s，再加入3.5%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6 000）充分搅拌溶解，室温下作用20 min。4 ℃下12 000      r/min离心30 min，2层滤纸过滤，在滤液中加入8.5%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6000），充分搅拌溶解，室温下作用20 min。4 ℃下12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，在沉淀物中加PBS（pH 7.4）溶液溶解，加12%（W/V）的聚乙二醇（PEG-6000），室温下作用10 min。4 ℃下12 000 r/min离心30 min，去上清，沉淀称重，在沉淀物中加入PBS（pH 7.4）溶液溶解（每10 mL卵黄原液用1 mL PBS溶液溶解），-20 ℃保存。

1.2.2 提取效率统计与纯度检验 根据提取效率=（离心管重+沉淀重）/所用卵黄液体积，统计各种方法的提取效率。通过SDS-PAGE电泳检测各种方法提取的IgY纯度。

1.2.3 特异性卵黄抗体的制备 采用特定抗原免疫蛋鸡，制备特异性卵黄抗体，验证以上最优工艺提取的IgY的免疫活性，具体步骤如下。

1）抗原蛋白StxB的制备与鉴定。取表达菌株菌液[BL21（DE3）-pET28a-STxB]50 μL，接种于200 mL含有卡那霉素（终浓度为200 ng/mL）的LB培养基中振荡培养16～18 h;次日，往200 mL菌液中分别加入100 mL LB培养基后再加入卡那霉素（终浓度为200 ng/mL）和IPTG（终浓度为1 mmo/L），诱导6 h;4 ℃下10 000 r/min离心10 min，收集菌体;菌体用PBS溶液悬起后进行超声裂解，超声参数为超声5 s，间隔5 s，时间为30 min，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，弃上清，加入PBS溶液将沉淀悬起，进行第2次超声，超声参数同上，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，弃上清，收集沉淀用40 mL包涵体溶解液悬起，超声辅助溶解即为抗原蛋白StxB。取制备样品进行SDS-PAGE电泳检测，之后采用Western blot鉴定：转膜完成后用2%的PBS-脱脂奶封闭1 h，之后加入以1∶2 000稀释的Anti-his mAb 37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次之后加入1∶2 000稀释的HRP-Goat-Anti-mouse IgG 37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次之后进行DAB显色。

2）疫苗制备与动物免疫。将表达得到的抗原蛋白StxB（3份）与疫苗佐剂MONTANIDETM ISA 71VG（7份）进行乳化，制备成免疫原StxB-71VG。将12只180日龄的海兰褐蛋鸡随机分为2组，每组6只，试验组胸部肌肉注射StxB-71VG，1 mL/羽，共免疫2次，间隔14 d，对照组不做免疫。

3）样品的采集与制备。于首次免疫后第0、7、14、21、35、49天翼下静脉采血1 mL，37 ℃放置3 h，4 ℃放置过夜，5 000 r/min离心5 min分离制备血清，血清样品于-20 ℃保存，用于抗体滴度检测。收集首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的鸡蛋，于 4 ℃保存，采用上述5种方法中提取效果最好的方法进行卵黄抗体的提取，用于后续抗体滴度检测。

1.2.4 重组蛋白STxB特异性血清抗体与卵黄抗体的免疫活性与滴度检测 采用Western blot方法检测抗原蛋白STxB特异性血清抗体与卵黄抗体，具体步骤如下：蛋白样品STxB通过蛋白凝胶电泳后，转印到PVDF膜上，用2%PBS-脱脂奶封闭1 h，PBST洗3次，再将“1.2.3”中制备的血清抗体或卵黄抗体作倍比稀释（初始浓度按1∶100稀释），稀释后的抗体与转印膜于37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，HRP-羊抗鸡二抗（1∶3 000） 37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次，DAB显色。以显色为阳性的最高稀释倍数表示血清抗体和卵黃滴度。

2 结果与分析

2.1 5种方法的提取效率与卵黄抗体纯度

试验结果表明，辛酸法（CA）、水稀释法（WD）、氯仿法（CF）、硫酸铵沉淀法（AS）和聚乙二醇沉淀法（PEG）的提取效率依次为96.00、81.99、155.50、65.34和46.00 mg/mL。

通过SDS-PAGE电泳检测所提取的IgY纯度，由图1可以看出，辛酸法所提IgY抗体纯度很低，重链（约66 kDa）不明显，轻链（约25 kDa）条带缺失，且杂蛋白条带较多（35～40 kDa）;水稀释法所提IgY其重链与轻链抗体链较明显，中间含有少量的杂带（35～40 kDa）;氯仿法所提IgY重链和轻链抗体链条带较明显，杂蛋白条带较多（35～55 kDa）;硫酸铵沉淀法的重链与轻链抗体链都比较明显，杂蛋白条带较多（35～55 kDa），纯度较低;聚乙二醇法重链与轻链抗体链均很明显，杂蛋白条带较相对较少，其纯度很高。

2.2 重组蛋白STxB的表达与鉴定

将得到的重组STxB蛋白（rSTxB）采用超声法进行3次纯化，分别在第1次、第2次、第3次超声完成后取500 μL，对3次纯化的溶液进行SDS-PAGE检测，结果在约25 kDa处出现清晰条带（图2a），与预期相符，可以看出第3次超声之后得到比较纯净的目的蛋白，基本没有杂带。重组STxB蛋白经Western blot鉴定，结果显示，在约25 kDa处出现清晰的特异性印迹条带，表明所纯化的蛋白为重组STxB蛋白（图2b）。

2.3 卵黄抗体提取效率及效价测定

用聚乙二醇法提取首次免疫后第0、14、21、28、35和49 天的鸡蛋的卵黄抗体平均提取效率分别为33.10、32.70、33.90、43.30、43.70和43.80 mg/mL。对首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的鸡蛋提取IgY，经SDS-PAGE检测纯度，结果显示重链和轻链明显，其他杂蛋白占比很低（图3）。

Western blot检测提取的IgY免疫活性及其效价，结果显示，首次免疫后第14、21、28天的鸡蛋的卵黄抗体与重组蛋白反应性良好，且呈阳性的最高稀释倍数依次为8 000、16 000和16 000倍（图4）。

为比较卵黄抗体与血清抗体效价之间的差异及其动态关联性，将血清样品稀释后进行Western blot效价测定，结果显示，首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的血清效价依次为0、12 800×、16 000×、 32 000×、64 000×和64 000×（图5）。

3 小结与讨论

本研究通过对辛酸法（CA）、水稀释法（WD）、氯仿法（CF）、硫酸铵沉淀法（AS）和聚乙二醇沉淀法（PEG）5种方法进行了比较，得出聚乙二醇沉淀法提取的卵黄抗体纯度最高。辛酸法的平均提取效率为96.00 mg/mL，在5种方法中提取效率较高，仅低于氯仿法，但其抗体纯度却最低，其容易和IgY以外的大部分蛋白质分子结合，形成不可逆的沉淀。水稀释法的平均提取效率为81.99 mg/mL，提取效率较高，纯度较高，只低于聚乙二醇法所提取的卵黄抗体纯度，且工艺简单、生产成本低、回收率高。氯仿法的平均提取效率为155.50 mg/mL，提取效率在5种方法中最高，但纯度与水稀释法相仿，纯度不高;研究表明，氯仿可使ELISA非特异性吸附从而造成假阳性[18]。硫酸铵沉淀法的平均提取效率为65.34 mg/mL，提取效率很低，高于聚乙二醇沉淀法，但提取纯度不高;聚乙二醇沉淀法的平均提取效率为46.00 mg/mL，在5种方法中纯度最高;且聚乙二醇亲水性强，可以在不造成蛋白质变性的情况下使IgY迅速沉淀[18]。

在试验的5种方法中，PEG沉淀法改进之后，与Pauly等[17]的试验方案相比，提取量多，纯度更高，所用步骤更少，所以本试验采用的聚乙二醇沉淀法（PEG法）更为简便，用时更少，更适合于工业化的批量生产。吴博等[14]的试验中，辛酸法提取效率较高，这有可能与辛酸的添加量有关。在本试验中辛酸只添加了25 μL，与吴博等[14]的试验中所添加的1%～3%的辛酸量相差较大，因此该方法或许可以加大辛酸的添加量以获得更好的提取效果。水稀释法的试验结果与Ren等[15]的试验结果基本一致。有研究发现聚乙二醇易与蛋白质疏水区碰撞，形成可逆性的沉淀复合物，可以与蛋白质一起沉淀出来[19]。在朱旭国等[20]的试验中提到，随着聚乙二醇浓度的增大，卵黄抗体提取率先增加，之后却逐渐降低，谭佩毅等[21]的试验中发现，聚乙二醇浓度大于8.0%时，卵黄抗体提取率逐渐降低。索江华等[22]的研究结果显示，3.5%的PEG浓度为最佳去脂浓度，1∶9的水稀释法去脂高但抗体效价下降较多，硫酸酯葡聚糖浓度增加至1.8%以上时抗体效价有所下降。任平国等[23]采用水稀释法以1∶8稀释时，蛋白質和脂肪的含量趋于稳定。李敏惠等[1]先用水稀释法再用两步硫酸钠盐析法，IgY的纯度达到92%。任春芝[24]试验中水稀释法稀释1～10倍发现，当将卵黄液5倍稀释时，上清液中可溶性蛋白质含量最低，9倍稀释时含量最高，稀释倍数再增高含量又会降低，卵黄液的最佳稀释倍数为9倍稀释。阳元娥[12]试验中提出，12%的PEG沉淀法是最为有效的沉淀方法。另外，在韩继刚等[25]的试验中提到，聚乙二醇的沉淀效果不仅取决于小分子蛋白的特性和浓度，还取决于溶液中盐的浓度。在聚乙二醇沉淀法中或许可以考虑聚乙二醇与适量的中性盐结合添加，以获得更好的聚乙二醇沉淀效果。在本试验中，对聚乙二醇沉淀法改良分别添加了3.5%、8.5%、12% 3次不同浓度的聚乙二醇。聚乙二醇的提取效率相对较低，与聚乙二醇的添加步骤与浓度是否有关，以及通过降低聚乙二醇浓度是否能提高聚乙二醇沉淀法的提取效率，对此方面还需要做进一步研究。本试验所采用的聚乙二醇沉淀法在提取步骤上仍然有不足的地方，聚乙二醇在卵黄抗体中有少量的残留，工业化生产完成后还需要再次清除残留的聚乙二醇。在去脂方面，聚乙二醇沉淀法离心后收集的上清液微黄，去脂效果不是很好，但硫酸铵沉淀法得到的上清液十分清澈，具有很好的去脂效果，或许可以考虑在聚乙二醇沉淀法的基础上与硫酸铵沉淀法适当地结合以取得良好的去脂效果。

为了研究聚乙二醇沉淀法提取IgY的免疫活性，对重组载体BL21- pET28a-STxB菌株进行大量表达、制备免疫原免疫蛋鸡、采集翅静脉血清与鸡蛋，经SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明，纯化后的STxB蛋白基本上没有杂带，血清和卵黄中抗体具有较好的特异性。用聚乙二醇沉淀法提取首次免疫后第14、21、28天的鸡蛋的卵黄抗体比首次免疫后第0、14、21、28、35、49天的血清抗体更稳定，这与高岭[26]研究的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻卵黄抗体特性一致，而王金洛等[27]的研究中卵黄抗体效价高于血清抗体效价，与本试验结果有差异，这可能与免疫程序和收蛋的时间点不同有关。

改良后的聚乙二醇沉淀法在5种方法中是最优良的提取方法，其成本低，步骤简便，提取的卵黄抗体数量多，提取效率较高且质量好，拥有很高的卵黄抗体纯度与很高的抗体效价。因此，对改良后的聚乙二醇沉淀法进行卵黄抗体工业化生产是可行的。

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