周昂摺，周巧婷，周恩牧，金建忠

（浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015）

波罗蜜Artocarpus heterophyllus为桑科Moraceae 波罗蜜属Artocarpus植物，是典型的热带果树，原产于印度，现在我国广东、广西、海南、云南、福建和四川南部的热带、南亚热带地区均有栽培[1]。波罗蜜果肉爽脆、蜜甜、芳香味浓，肉色橙黄鲜艳，富含糖、蛋白质、维生素A、维生素C 以及人体所必须的钾、钙、锌等元素[2]。目前，对波罗蜜加工利用的部分主要是其果肉，而其果皮和种子通常被当作废弃物丢弃，这不但浪费资源，而且对环境造成污染[3]。波罗蜜种子呈椭圆形，不仅富含淀粉，还含有脂肪、挥发油、多酚、蛋白质和纤维素等，是有待开发加工利用的新资源[4]。目前，对波罗蜜种子的研究主要集中在其淀粉特性及提取制备上[4]，对其多酚的研究较少[5]。植物多酚亦称植物单宁，其在抗氧化、抗突变、抗肿瘤等很多方面具有突出作用和广泛的保健功能，其中，最重要的是抗氧化功能[6]。现有对植物多酚的提取方法主要有溶剂提取法[7-9]、离子沉淀法[10-12]、超声波辅助提取法[13-14]、微波辅助提取法[15-16]、生物酶提取法[17-19]、超临界CO2提取法[21-22]等。本文以波罗蜜种子为研究对象，采用超声波辅助萃取技术提取多酚，通过单因素和正交试验进行提取工艺的优化实验，以期为波罗蜜种子开发新的利用方向，减少环境污染。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

没食子酸，福林酚试剂，无水Na2CO3，95%乙醇（分析纯）；波罗蜜种子（购自广东湛江，为当年生种子）。

1.2 仪器与设备

LSA-E24/1200 超声波清洗器（杭州法兰特超声波科技有限公司），Evolution 201 紫外可见分光光度计(中国Thermo)，AB204-N 电子天平（美国奥豪斯）。

1.3 实验方法

1.3.1 超声波辅助萃取方法 将在100℃干燥至恒质量的波罗蜜种子直接粉碎并过30 目筛，获得波罗蜜种子粉末。精确称取0.400 0 g 波罗蜜种子粉末于25 mL 比色管中，首先固定超声时间为40 min，料液比为1∶50（g·mL-1），超声功率为85 W，超声温度为50℃，改变乙醇浓度进行乙醇浓度单因素试验，当温度达到设定值时将比色管放入仪器中超声萃取，超声结束后过滤得提取液。确定最佳乙醇浓度后再依次进行其他因素的试验。

为了全面考察超声波辅助萃取波罗蜜种子多酚时各因素对其的影响，在单因素实验的基础上设计正交试验。考察超声温度（A）、超声时间（B）、超声功率（C）、料液比（D）和乙醇浓度（E）五个因素对波罗蜜种子多酚产量的影响，选用L16(45)正交表，考察因素、水平及正交试验结果见表1。

表1 正交试验结果及分析Table 1 Result of orthogonal test and analysis

1.3.2 多酚的测定

1.3.2.1 标准曲线绘制 准确吸取40 μg·mL-1没食子酸标准溶液0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL 分别置于6 支25 mL 具塞比色管中，依次加入8.75 mL 的20%福林酚试剂、5.00 mL7.5%的Na2CO3溶液，加水定容，放置40 min 后以空白样品为参比溶液，在760 nm 波长处测其吸光度。以浓度（C）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为：

1.3.2.2 最佳波长的选择 按1.3.2.1 的测定方法分别测定没食子酸和波罗蜜种子多酚提取液的吸收曲线，见图1。由图1 可知，没食子酸和波罗蜜种子多酚提取液经显色反应后的光谱曲线形状相似，均在760 nm 处有最大吸收。所以，测定波罗蜜种子多酚含量可以用没食子酸作为标准物质，同时，以760 nm 为最佳波长。

1.3.2.3 波罗蜜种子多酚的测定 将超声波辅助萃取所得的多酚提取液置于25 mL 容量瓶，用水定容，移取上述样品溶液1.25 mL 于25 mL 具塞比色管，按标准曲线测定方法测定其吸光度，由没食子酸标准溶液的线性回归方程计算出比色管中波罗蜜种子多酚提取液的浓度C，并计算波罗蜜种子中多酚的产量，其方程如下：

图1 没食子酸和波罗蜜种子多酚吸收曲线Figure 1 Absorption curves of gallic acid and polyphenols

1.4 数据分析

图表数据统计分析用Graphpad Prism 软件，正交设计及分析采用正交设计助手软件。

2 结果与分析

2.1 波罗蜜种子多酚的超声波辅助萃取单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对波罗蜜种子多酚提取量的影响 固定超声时间40 min，料液比1∶50，超声功率85 W，超声温度50℃，控制乙醇浓度分别为60%，65%，70%，75%，80%时进行萃取，结果见图2。由图2 可知，波罗蜜种子多酚提取量随着乙醇浓度的升高呈先增加后降低的趋势，在乙醇浓度为60%～ 70%时，提取效果呈现上升趋势，到70%时提取效果为最佳，多酚提取产量达3.688 mg·g-1；当乙醇浓度高于70%时，提取效果逐渐下降。

2.1.2 超声温度对波罗蜜种子多酚提取的影响 固定乙醇浓度为70%，料液比为1∶50，超声时间为40 min，超声功率为85 W，控制超声温度分别为35℃，40℃，45℃，50℃，55℃时进行波罗蜜种子多酚提取，结果见图3。由图3 可知，随着处理温度的逐渐上升，提取效果呈现先上升后下降的趋势，在超声温度在35～ 45℃时，提取效果呈现上升趋势，当温度达到45℃时提取效果最佳，多酚提取产量达3.938 mg·g-1。当温度高于45℃时，提取效果呈下降趋势。这是因为温度过低，乙醇提取波罗蜜种子多酚不完全，但温度过高酒精挥发量增多，使提取效果降低。

图2 乙醇浓度对波罗蜜种子多酚提取量的影响Figure 2 Effect of ethanol concentration on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

图3 超声温度对波罗蜜种子多酚提取量的影响Figure 3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

2.1.3 料液比对波罗蜜种子多酚提取量的影响 固定超声温度为45℃，乙醇浓度为70%，超声时间为40 min，超声功率为85 W，控制波罗蜜种子粉末和乙醇的料液比分别为1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 时进行提取，结果见图4。由图4 可知，随着乙醇用量的增多，提取效果呈现上升趋势，当料液比达到1:40 时提取效果达到最佳，为3.952 mg·g-1。当料液比低于1∶40 时，提取效果基本保持不变。这是因为在乙醇用量达到一定量时，加入的乙醇所能提取出多酚的量已经达到饱和，当乙醇用量继续增加，料液比达到1∶40 时，其样品中的多酚最大限度的被提取出来，所以料液比低于1∶40 后提取效果基本不变。

2.1.4 超声时间对波罗蜜种子多酚提取量的影响 在超声温度为45℃，料液比为1∶40，乙醇浓度为70%，超声功率为85 W，超声时间分别为10 min，20 min，30 min，40 min，50 min 时进行波罗蜜种子多酚提取，结果见图5。由图5 可知，随着超声时间的增加，提取效果呈现先上升后下降的趋势，当超声时间在10～ 30 min 时，提取效果呈现上升趋势，当超声时间达到30 min 时，提取效果达到最佳，为4.275 mg·g-1；当超声时间超过30 min时提取效果有所降低，这是因为前30 min 是随着提取时间的延长，其提取越完全，但超过30 min 后随着超声时间的增加，其提取液中的乙醇挥发量增大，使其提取液中的有效乙醇浓度降低，从而使多酚提取量减少。

图4 料液比对波罗蜜种子多酚提取量的影响Figure 4 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

图5 超声时间对波罗蜜种子多酚提取量的影响Figure 5 Effect of ultrasonic time on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

2.1.5 超声功率对波罗蜜种子多酚提取量的影响 固定超声时间为30 min，料液比为1∶40，超声温度为45℃，乙醇浓度为70%，改变超声功率分别为55 W，65 W，75 W，85 W，95 W 时进行提取，结果见图6。由图6 可知，随着超声功率的增大，空化强度增大，多酚提取量呈现上升趋势，当超声功率达到65 W 时，提取效果达到最佳，为5.030 mg·g-1。但超声功率过高会产生大量的无用气泡，增加散射衰减，形成声屏障，同时也会增加非线性衰减，故当超声功率高于65 W 时多酚提取量呈现下降趋势。

2.2 超声波辅助萃取波罗蜜种子多酚的正交试验

由正交试验结果（见表1）表明，波罗蜜种子多酚的超声波辅助萃取各因素对多酚产量影响程度的大小顺序为：E＞A＞D＞C＞B。最佳提取条件为A3B1C1D4E1，即超声温度为45℃、超声时间为10 min、超声功率为55 W、料液比为1∶50、乙醇浓度为60%。

由表2 的方差分析结果表明，超声波辅助萃取各因素对多酚产量影响程度的大小顺序为：E＞A＞D＞C＞B，与表1 的直观分析结果一致，且各因素的F值＜F0.05（3，3），表明各萃取条件对多酚产量的影响都不显著。

图6 超声功率对波罗蜜种子多酚提取量的影响Figure 6 Effect of ultrasonic power on yield of polyphenols from A.heterophyllus seeds

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.3 验证试验

在正交实验所得的最佳萃取条件下重复萃取波罗蜜种子3 次，所得多酚的产量分别为5.261 mg·g-1，5.395 mg·g-1，5.451 mg·g-1，平均产量为5.368 mg·g-1。此提取条件与正交试验任意组对比，均大于各组萃取量，验证了所确定条件为最佳工艺条件。

3 结论

本文采用超声波辅助萃取了波罗蜜种子中的多酚，通过单因素试验和正交试验考察了超声时间、超声温度、乙醇浓度、料液比、超声功率5 种因素对波罗蜜种子多酚产量的影响。实验结果表明，各因素对波罗蜜种子多酚产量影响的大小顺序为：乙醇浓度＞超声温度＞超声功率＞料液比＞超声时间；其最佳萃取工艺条件为：超声温度45℃、超声时间10 min、超声功率55 W、料液比1∶50、乙醇浓度60%，在此条件下波罗蜜种子多酚产量达5.368 mg·g-1。但该工艺的料液比过低，在工业化生产时会造成浓缩能耗过大的问题，有待进一步研究解决。