吕 彬 ，谭旺晓 ，刘 潇，王小莹 ，2，高秀梅

（1.组分中药国家重点实验室，天津 301617；2.天津中医药大学中药学院，天津 301617）

中药补骨脂，又名破故纸、胡韭子、和兰苋，是豆科一年生直立草本补骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果实[1]，其性温，味辛、苦，归肾、脾经，具有温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻的功效，主要用于治疗肾阳不足，阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝冷痛，肾虚作喘，五更泄泻；外用治疗白癜风及斑秃[2]。现代药理学研究发现，补骨脂具有雌激素样作用[3]，能够增加骨密度，多用于治疗骨质疏松[4]；此外，补骨脂还有抗肿瘤、抗应激、抗血栓形成等作用[5-7]，在临床上应用较为广泛。补骨脂生品性燥，易伤阴助火，具有一定的毒副作用[8-9]，因此临床上多使用其炮制品。《普济本事方》《本草纲目》等医学古籍中对补骨脂应用的记载也均以其酒制品和炒制品为主，生品使用较少。补骨脂炮制方法始见于《雷公炮炙论》，曰：“凡使，性本大燥，毒，用酒浸一宿，漉出，却用东流水浸三日夜，却蒸从巳至申出，日干用。”[10]后世医家在雷公法的基础上发展出盐炙、酒浸、清炒等炮制方法[11]。其中，酒浸炒法始见于宋代《太平惠民和剂局方》；元代《瑞竹堂经验方》记载补骨脂炮制方法为“酒浸一宿，焙干”；明代至清代的炮制方法主要是用水浸泡后再蒸三时[12]。其余古籍如《太平圣惠方》《本草乘雅半偈》等也对补骨脂炮制方法有所记载。《雷公炮炙论》中提出补骨脂炮制的目的是为了解燥毒[13]，后世如《太平惠民和剂局方》中记载的盐炒法、《经史证类备急本草》中提到的“入药微炒用”等，也均以减燥毒为目的[12]。《中国药典》中收载的补骨脂炮制方法为盐炙法[2]，中药炮制理论提到入盐走肾，盐炙法能够增强补骨脂补肾纳气的功效[14]，在临床应用中也主要以其盐制品为主[11]。有学者对补骨脂不同炮制品有效成分补骨脂素进行了含量测定，发现雷公法炮制品中补骨脂素的含量远高于盐炙品，认为盐炙法不是最佳的炮制方法[15-16]。现代对于补骨脂雷公炮制方法描述为将补骨脂浸泡于黄酒中1 d，之后滤去黄酒，以清水浸泡药材3 d，经过滤、沥干后，置于锅中隔水蒸6 h后取出，晒干。研究表明[17]，经雷公法炮制后，补骨脂毒性明显降低，可能与其炮制前后化学成分的变化有关。在现代炮制的研究中，为了优化炮制工艺，通常是先选择药物中某几种主要成分作为标志性成分，再以不同方法对药物进行炮制，并根据标志性成分的含量差异对炮制工艺进行筛选，而炮制前后标志性成分的变化在炮制原理的研究中意义重大[18]。笔者从炮制前后化学成分的变化分析雷公炮制法对补骨脂的影响，以探究雷公炮制法减毒的机制。

1 补骨脂肝损伤的相关化学成分研究

有关补骨脂的毒性记载始见于南北朝的《雷公炮炙论》，“性本大燥，毒”。《本草新编》中虽未言明补骨脂具有毒性，但指出补骨脂“其性过于燥”“不可轻用”。其余古籍文献中皆未见明确的补骨脂毒性记载，但对其燥性均有一定的描述，提出补骨脂性“大温而燥”，历代医家均认为“阴虚火旺者忌服”。近年来，随着对补骨脂研究的深入，且临床对于补骨脂不良反应的报道越来越多，补骨脂用药的安全性也引起了广泛的关注。娄鑫等[19]建立了一种新的有毒中药分级方法，将补骨脂归为“能导致毒性中药”；现代医药典籍如《中药大辞典》《中华本草》等对于补骨脂毒性也均有所记载。

现代药理学研究表明，补骨脂主要毒性为肝脏毒性。据报道[20]，长期给予大剂量补骨脂生药，对大鼠肝脏和肾脏功能均造成一定损害。补骨脂能够造成小鼠肝细胞坏死，血清中谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及炎症因子表达上升，并引起肝细胞线粒体膜电位的降低[21]。补骨脂化学成分较为复杂，自1933年分离出第1个单体成分补骨脂素起[22]，至今已分离并鉴定出80余种化学成分，主要包括香豆素类、苯并呋喃苷类、黄酮类及单萜酚类化合物[23]。其中，补骨脂苷、异补骨脂苷等苷类成分主要分布于种子中，补骨脂酚和黄酮类成分存在于补骨脂果皮中，补骨脂素、异补骨脂素等脂溶性香豆素在果皮和种子中均有分布[24]。补骨脂中的主要成分（异）补骨脂素、（异）补骨脂苷均存可造成一定程度上的肝损伤，是补骨脂肝毒性的主要来源。补骨脂中主要化学成分见图1。

图1 补骨脂中主要化学成分结构图Fig.1 Structure of main chemical components in Psoralea corylifolia

1.1 补骨脂肝损伤的临床表现 近年来，关于补骨脂造成肝损伤的临床报道屡见不鲜。2005年，韩国1例44岁妇女以补骨脂泡茶饮用，产生急性胆汁淤积性肝损害，患者有黄疸表现，肝穿刺显示肝脏有明显坏死[25]。2001年和2008年，国家药品不良反应监测中心两次通报壮骨关节丸（含补骨脂素0.532 mg/g，异补骨脂素0.518 mg/g[26]）能够造成肝损害，目前已有研究证实其造成肝损伤的成分为乳香、没药和补骨脂[27]。2006年报道1例22岁男性患者使用驱白巴布期片（维药，含补骨脂素1.15 mg/片，异补骨脂素0.91 mg/片[28]）和补骨脂注射液（含补骨脂素18.66 μg/mL，异补骨脂素36.55 μg/mL[29]）后，出现黄疸和肝脏生化异常，停药9周后检测肝脏生化正常，后经毒理学分析，引起肝损伤的药物成分主要为补骨脂中的成分[30]。2018年报道1例49岁男性患者使用驱白巴布期片联合补骨脂颗粒治疗白癜风，用药1个月后患者血清中ALT、AST及谷氨酰转移酶（GGT）表达明显升高，给予保肝药9周后检测肝脏生化指标恢复正常，推测补骨脂为引起该患者肝损伤的主要药物，其原因可能与两药联用导致补骨脂剂量加大有关[31]。夏叶等[32]在研究中发现，使用加味青娥方（每1 g加味青娥方中含补骨脂生药5 g）治疗的36例患者中，出现1例ALT水平升高，但情况较为轻微；付舒菲等[33]使用丹知青娥方（含补骨脂素2.1 mg/g，异补骨脂素1.8 mg/g）治疗更年期症状，出现多例心悸、胃部恶心、便秘、多眠等不良反应，16例参与者在治疗8周后表现出较高的转氨酶水平，治疗停止后肝功能检测恢复正常。加味青娥方主要组成药物为丹参、杜仲、补骨脂，丹知青娥方则在此基础上加入中药知母。其中，丹参、知母、杜仲均未见报道具有肝毒性，且多项研究证实此3味中药对肝损伤均具有保护作用[34-36]，文献作者推测补骨脂为两方引起肝损伤的主要药物。

1.2 补骨脂肝损伤成分研究 目前动物实验研究提示，肝损伤的程度与补骨脂给药时间、剂量呈一定的相关性[37]。张玥等[38]研究发现，小鼠连续腹腔注射80 mg/kg的补骨脂素和异补骨脂素4周后，补骨脂素组小鼠血清中碱性磷酸酶（ALP）水平明显降低，异补骨脂素则会引起小鼠血清中ALT和AST的水平上升，ALP水平下降。病理学检查显示补骨脂素组小鼠肝脏内可见散在局灶性坏死，异补骨脂素组部分小鼠肝脏有肝细胞变性，提示补骨脂素和异补骨脂素均能造成一定程度上的肝损伤；此外，100 μmol/L的异补骨脂素可以抑制多药耐药相关蛋白 2（MRP2）、多药耐药相关蛋白 3（MRP3）的表达，从而引起HepG2细胞内胆汁酸升高和细胞毒性[38-39]。宋蕾等[40]研究发现，采用100 mg/kg的异补骨脂素连续灌胃给药ICR小鼠9 d，雌性小鼠肝功能下降，肝脏系数及血清中ALT和AST水平显著升高，肝脏中胆汁酸盐输出泵（BSEP）、钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）和有机阴离子转运多肽2（OATP2）的mRNA水平均有所降低。连续灌胃给予大鼠异补骨脂素40 mg/kg，给药28 d后，能够对大鼠肝微粒体中的细胞色素P450酶（CYP450）产生影响，造成转氨酶升高，进而引起肝脏损伤[41]。补骨脂水提物中存在大量的补骨脂苷和异补骨脂苷，连续灌胃给予小鼠80 g/kg的补骨脂水提物14 d，能够使其肝脏BSEP和NTCP表达显著降低，影响胆汁酸转运体的表达[42]；连续灌胃给予大鼠2.1 g/kg的补骨脂水提物12周，能够引起大鼠肝脏出现中度弥漫性脂肪变性[43]。王昭昕等[44]采用70%乙醇渗漉提取补骨脂中的有效成分，给予大鼠不同剂量的补骨脂提取物（生药组为3 g/kg，其余各组低剂量组为3 g/kg，高剂量组为6 g/kg），连续灌胃给药4周后发现，补骨脂生药组、补骨脂下层渗漉液高剂量组（主要含有补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚）与渗漉药渣高剂量组（主要含有补骨脂苷和异补骨脂苷）能够造成明显的肝损伤，其中渗漉药渣高剂量组大鼠肝损伤最为明显，推测（异）补骨脂苷肝毒性高于其他成分。本课题组前期研究也证实[45]，分别给予大鼠补骨脂水提物（主要含补骨脂苷、异补骨脂苷）及补骨脂水提后的干燥药渣（主要含补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚），灌胃给药4周后水提物药渣组大鼠肝损伤程度明显低于生药组。黄酮类成分补骨脂甲素和Corylifol A能够抑制肝脏微粒体中的葡糖醛酸转移酶1A1，可能是造成胆红素水平上升的原因[46]；但对其作用的评价仅局限于体外酶活性检测，对机体肝脏的影响仍有待探究。周昆等[47]发现HepG2细胞的存活率与补骨脂酚终浓度和作用时间呈负相关，但是小鼠灌胃给予50 mg/kg补骨脂酚未产生明显的肝损伤，提示补骨脂酚肝毒性较小。

上述研究表明，（异）补骨脂素、（异）补骨脂苷和补骨脂酚均能造成一定程度的肝损伤，其中补骨脂酚肝毒性最小，（异）补骨脂苷的肝毒性高于（异）补骨脂素。尽管已有多项实验证实（异）补骨脂苷的肝毒性较强，但对于补骨脂中毒性成分的研究仍有所欠缺，需进一步完善。笔者对补骨脂中主要肝毒性成分的半数致死量（LD50）、半数有效量（ED50）及毒性剂量进行检索，发现仅白茹玉等[48]报道了补骨脂素与异补骨脂素小鼠单次灌胃给药的LD50分别为638.69 mg/kg与351.72 mg/kg；其余成分的LD50及补骨脂主要成分的ED50和毒性剂量等均未见报道。对补骨脂毒性成分的深入研究，不仅能够为补骨脂临床用药提供参考，同时对补骨脂减毒的探究也具有指导意义。

补骨脂中主要的活性成分为补骨脂素和异补骨脂素。《中国药典》规定，补骨脂安全剂量为6～10 g/d，且饮片中补骨脂素和异补骨脂素总含量不得少于0.7%。在关于（异）补骨脂素引起肝损伤的实验中，给药剂量均远大于规定用量（约为生药规定剂量的5～10倍，根据成分含量及体表面积折合计算），且多数研究给药时间较长。（异）补骨脂素口服给药的消除半衰期超过4 h，且给药后24 h仍未代谢完全[49]；长时间持续给药会引起代谢不及时，大量的（异）补骨脂素在体内蓄积，从而引起肝脏损伤。此外，本课题组前期研究发现[45]，（异）补骨脂苷在补骨脂中含量较高，且能够在体内代谢转化为（异）补骨脂素，使服用补骨脂后（异）补骨脂素的体内暴露量明显升高，最终过量的（异）补骨脂素导致肝损害的发生。而且，由于（异）补骨脂苷含量的不确定性，也使得（异）补骨脂素含量的控制变得毫无意义。因此，在用药剂量不超过规定剂量的条件下，通过炮制的方法降低补骨脂中毒性成分（异）补骨脂苷的含量，同时保证活性成分（异）补骨脂素含量符合其有效剂量，对保障补骨脂用药的安全性和有效性具有重要意义。

2 补骨脂“雷公炮制法”减毒机制

有关补骨脂的炮制理论始见于南北朝的《雷公炮炙论》，提出补骨脂炮制的目的是解其“燥毒”。在炮制过程中，由于受到炮制条件的影响，补骨脂内在成分会发生质或量的改变，毒性成分（异）补骨脂苷转化为活性成分（异）补骨脂素，从而达到炮制减毒的目的。补骨脂素具有抗癌、调节免疫和雌激素样作用，在血浆中代谢消除缓慢[50]，被认为是补骨脂中的主要活性成分，常作为指标成分用于补骨脂及其相关制品的质量控制。有关研究表明，（异）补骨脂苷与（异）补骨脂素具有一定的生物转化关系[51]，可能与补骨脂中存在的β-葡萄糖苷酶有关[52]。（异）补骨脂苷和（异）补骨脂素是补骨脂水煎液入血的主要活性成分[53]，（异）补骨脂苷在大鼠体内吸收较快，并在一定时间后转化为（异）补骨脂素[54]。王跃飞等[55]研究发现，（异）补骨脂苷可通过肠道微生物发生去糖基化，代谢为（异）补骨脂素。此外，（异）补骨脂苷在体外可以通过酸水解进行转化，转化条件为水解反应温度100°C、盐酸浓度3 mol/L、水解时间30 min[56]。在雷公法炮制过程中，通过酒浸可去除部分（异）补骨脂素及少量的（异）补骨脂苷，但其具体含量变化未见明确报道。王昭昕等[42]采用70%乙醇渗漉提取补骨脂中的有效成分，发现提取后补骨脂中（异）补骨脂素含量下降约60%，（异）补骨脂苷含量下降约19%，而酒浸后补骨脂化学成分含量的变化应低于渗漉提取。随后，水浸、高温加热等条件则促进了（异）补骨脂苷的浸出和转化。宋潇等[57]研究发现，与生品组相比，补骨脂雷公炮制组中（异）补骨脂素的增加量约为（异）补骨脂苷的减少量的一半左右；而在酒浸炒法中，补骨脂素和异补骨脂素的含量增加值等同于补骨脂苷和异补骨脂苷的含量下降值，提示在雷公法炮制过程中有一部分（异）补骨脂苷在酒、水浸泡和水蒸过程中被消耗掉。此外，炮制后补骨脂中另一毒性成分补骨脂酚含量也有所降低。酒、水浸泡可以使补骨脂药材结构趋于疏松，补骨脂酚在后续炮制过程中易于逸出；水蒸可以促进补骨脂酚受热挥发[58]。李娜等[59]比较了补骨脂经不同方法炮制后补骨脂酚的含量变化，发现与生品组相比，雷公法与水蒸法炮制品补骨脂酚含量下降约12%；酒浸炒法与药典法炮制均能促进补骨脂酚含量上升；清炒法与生品组相比无明显变化，证实“水蒸”能够降低补骨脂酚的含量。杨滨等[16]的研究也证实了补骨脂经雷公法炮制后，与生品相比补骨脂酚的含量下降约为10%左右。尽管在酒浸过程中，补骨脂中的有效成分（异）补骨脂素有所消耗，但在后续工艺中，经（异）补骨脂苷转化而成的（异）补骨脂素则能够弥补这一损耗，且能保证（异）补骨脂素含量处于安全剂量范围。郭晏华等[60]对不同批次的补骨脂炮制前后（异）补骨脂素含量进行检测，发现与生品组相比，雷公法炮制组中各批次（异）补骨脂素含量均略有上升，且符合药典标准；多项研究证实经雷公法炮制后补骨脂中（异）补骨脂素含量均略高于生品组[59，61-62]。经雷公法炮制后，（异）补骨脂苷已于炮制过程中完成转化，因此服用补骨脂雷公法炮制品后，进入体内的（异）补骨脂苷含量较少，其在体内转化而成的（异）补骨脂素也会被迅速代谢，有利于对（异）补骨脂素的含量进行控制，使得体内（异）补骨脂素的含量处于安全用药范围。宋迪等[63]基于《雷公炮炙论》，以HepaRG细胞3D培养获得的类人肝脏模型结合高内涵成像技术，证实了《雷公炮炙论》中记载的酒浸水漂法能够有效降低补骨脂的肝毒性，并设计出最优减毒工艺。通过炮制，补骨脂中燥性成分含量减少，印证了补骨脂炮制理论中炮制的目的是为了解燥毒的科学性。在补骨脂雷公法炮制过程中，先通过酒浸去除部分（异）补骨脂苷和（异）补骨脂素，再通过水浸促进部分毒性成分（异）补骨脂苷的浸出，最后通过水蒸的方法促进残留的毒性成分（异）补骨脂苷转化为活性成分（异）补骨脂素，同时促进补骨脂酚的受热挥发，使得（异）补骨脂素的含量保持在有效剂量范围内，保障了补骨脂用药的安全性及有效性，最终达到炮制减毒的目的，见图2。

图2 补骨脂雷公炮制法减毒机制Fig.2 Attenuation mechanism of Psoralea corylifolia by“Leigong processing method”

补骨脂作为温肾助阳的传统中药，在临床上应用广泛。补骨脂生品毒性较强，主要表现为慢性肝损伤，也有研究发现其中的单萜酚类成分补骨脂酚能够造成肾脏损伤。江芳等[64]发现，补骨脂酚能促进HK-2细胞的凋亡、坏死，造成细胞膜脱落，且呈剂量和时间依赖性，判断补骨脂酚能够抑制肾脏细胞DNA的合成及有丝分裂，或直接破坏细胞膜，进而引起细胞凋亡，直接造成肾脏的损伤。补骨脂酚在补骨脂中含量较高，约占整体成分的4%[65]，但其在体内溶解度较低，生物利用度较差[66]。张玉顺等[67]使用补骨脂酚（相当于生药量18.75、37.5、75 g/kg）连续灌胃昆明小鼠7、14、21和28 d后，出现不同程度肾脏病理性损害，且仅在小鼠中发现，在狗的研究中未见相同结果。此外，给予昆明小鼠连续灌胃21 d补骨脂不同炮制品水煎浸膏5 g/kg（补骨脂生药量为临床用量的25倍），发现肾小球毛细血管丛的内皮细胞及间质细胞核增大[9]。在肾毒性的实验中，补骨脂酚的使用剂量均远高于《中国药典》规定的用药剂量范围（6～10 g），在常规剂量下尚未见有肾毒性报道，推测补骨脂酚的肾毒性可能与其高给药量有关[68]，临床上也未见补骨脂造成肾脏损伤的报道。

雷公法是传统的补骨脂炮制方法，炮制后补骨脂毒性明显降低，其炮制减毒的机制与主要毒性成分（异）补骨脂苷的含量下降有关。目前，对于补骨脂炮制减毒的研究仍存在许多问题。首先，对于补骨脂中毒性成分的研究仍需进一步完善；其次，在炮制过程中，不同炮制步骤如酒浸、水浸及水蒸等对补骨脂中成分的影响仍有待研究，明确各炮制步骤对补骨脂成分的影响，有利于为补骨脂炮制工艺的优化提供指导。笔者阐述了补骨脂毒性及相关成分，对雷公炮制法减毒的科学内涵进行探究，为补骨脂炮制减毒的研究提供科学依据。