蒋诗梦 黄仁志 蒋勇兵 贾超华 秦志雄

(湖南省蚕桑科学研究所，湖南长沙 410127)

桑树作为污染耕地替代种植的经济作物，对重金属有一定的耐受性，其地上部分对镉(Cd)、铅(Pb)的富集系数小于1，富集能力有限[1]，而据文献报道在土壤中添加螯合剂可以促进植物对重金属的吸收，提高其对重金属的富集转移效率[2]，且不同螯合剂对同一种重金属增溶效果不同，同一种螯合剂对不同金属离子的螯合能力也不相同[3]。螯合剂在诱导植物修复污染土壤的过程中对植物生长的影响包括低浓度的螯合剂能促进鬼针草[4]、商陆[5]的生长，随着螯合剂添加浓度的增加，玉米、苎麻中的重金属含量会呈现增加的趋势[6-7]，同时过高浓度的螯合剂又会对植物生长产生抑制作用[8-9]。目前，螯合剂对桑树修复重金属污染土壤的相关研究还未见报道，本文通过开展盆栽试验，分别添加活化能力强-衰减缓慢型的螯合剂乙二胺四乙酸(C10H16N2O8，EDTA)、中等活化能力-衰减显著型的二乙烯三胺五乙酸(C14H23N3O10，DTPA)、低活化能力型的柠檬酸(C6H8O7·H2O，CA)[10]来探讨螯合剂添加种类、浓度对桑树生长及土壤中Cd、Pb含量的影响，旨在筛选出在污染耕地中适合与桑树联合使用的螯合剂，为桑树修复土壤重金属污染的应用技术提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤和桑苗 供试土壤取自湘西洞口县花园镇宝万村的污染土壤，Cd含量为11.81±0.58 mg/kg，Pb含量为418.90±55.49 mg/kg，Cd、Pb含量分别为GB 15618—1995《土壤环境质量标准》[11]中各自自然背景的59倍和12倍。试验用的桑苗为农桑14号的实生苗，购自射阳县恒威蚕业专业合作社。

1.1.2 试验药剂与仪器 EDTA、DTPA、CA、丙酮均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司产品；PBS磷酸盐缓冲液，购自上海瑞楚生物科技有限公司；蛋白检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒、过氧化物酶(POD)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；752N紫外可见分光光度计，上海分析仪器总厂产品。

1.2 试验方法

1.2.1 盆栽处理 将供试土壤拌好装入盆中，每盆装土12 kg，然后分别添加螯合剂EDTA、DTPA、CA，每种螯合剂分别设置低浓度(1.00 mmol/kg)、中浓度(5.00 mmol/kg)、高浓度(10.00 mmol/kg)和空白对照(CK)4组处理，每组处理均设置3个重复，共计36盆。每盆栽植1株桑苗，栽植后整形剪枝，每枝留3～4个芽苞，从3月至10月，做好盆栽苗的日常管理，定期浇水、施肥、松土。

1.2.2 桑苗生长状况调查 7月中旬，统计每组盆栽桑苗的枝条总数，测量桑苗枝条长度、叶片数及最大叶幅，根据以上数值衡量桑苗的生长状况。

1.2.3 叶绿素含量测定 9月中旬，在最终取样前，用内径为13 mm的不锈钢打孔器切取桑苗顶部的叶片，放入80%的丙酮溶液中过夜后提取叶绿素，分别用752N紫外可见分光光度计测定提取液的645 nm和663 nm的吸光度值，根据公式计算叶绿素含量：叶绿素含量(mg/dm2)=[0.5(20.29A+8.05A1)]/S，式中的A为645 nm吸光度值，A1为663 nm吸光度值，S为内径13 mm的打孔器切取的叶片面积。

1.2.4 抗氧化酶活性测定及MDA含量测定 10月最终取样时，准确称取叶片质量，按叶片质量(g)∶磷酸盐缓冲液体积(mL)=1∶9的比例，加入0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，冰浴研磨，3 500 r/min离心10 min，取上清液制成10%的组织匀浆。取10%的组织匀浆，按照蛋白检测试剂盒说明书中的操作步骤检测叶片样品中的蛋白浓度后，再分别用试剂盒检测并计算叶片样品中T-SOD、POD、CAT酶的活性及叶片中MDA的含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 螯合剂种类及添加浓度对桑苗生长的影响情况

从不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗的枝条总数、枝条长度、叶片数及叶片最大叶幅的影响情况(表1)可以看出：整个生长周期中，添加不同浓度CA的桑苗长势均较好，添加中浓度、高浓度EDTA和高浓度DTPA的桑苗长势较差，叶片过早出现掉落、黄化、止芯的现象；随着螯合剂添加浓度的升高，桑苗枝条总数、叶片最大叶幅总体呈下降的趋势。另外，桑苗枝条长度的统计分析结果表明：添加不同浓度的CA对枝条长度无显著影响，而添加中浓度、高浓度的DTPA和EDTA可使枝条长度显著低于对照组；添加不同浓度的DTPA和CA对桑苗叶片数无显著影响，而添加高浓度的EDTA使桑苗叶片数显著低于对照组(表1)。

表1 不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗的枝条总数、枝条长度、叶片数及叶片最大叶幅的影响情况

2.2 螯合剂种类及添加浓度对桑苗叶片中叶绿素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影响情况

从不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗的叶绿素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影响情况(表2)可以看出，添加不同浓度的CA对桑苗叶片的叶绿素含量、蛋白质含量、抗氧化酶活性及MDA含量均无显著影响，添加低浓度的EDTA对桑苗叶片的叶绿素含量、蛋白质含量、抗氧化酶活性及MDA含量也无显著影响；添加不同浓度的DTPA对桑苗叶片的SOD酶活性、CAT酶活性、MDA含量无显著影响，添加低浓度、中浓度的DTPA对桑苗叶片的叶绿素含量无显著影响，但添加中浓度、高浓度的DTPA使叶片蛋白质含量显著低于对照组，添加高浓度的DTPA使桑苗叶片POD酶活性显著高于对照组。试验还发现，添加中浓度、高浓度EDTA的桑苗出现接连死亡的情况，导致样品不足，所有数据均缺失。

表2 不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗的叶绿素含量、抗氧化酶活性及MDA含量的影响情况

2.3 螯合剂种类及添加浓度对桑苗根部土壤与桑苗根部Cd、Pb含量的影响情况

从不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗根部土壤与桑苗根部Cd含量的影响情况(表3)可以看出：添加不同浓度的CA对桑苗根部土壤Cd含量无显著影响；但添加DTPA、EDTA对桑苗根部土壤中的Cd含量有显著影响，其中添加中浓度、高浓度的DTPA和高浓度的EDTA均使桑苗根部土壤Cd含量显著低于对照组。从表3还可以看出，随着添加螯合剂浓度的增加，桑苗根部Cd含量值会出现差异，但统计分析表明差异并未达到显著水平。

表3 不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗根部土壤与桑苗根部Cd含量的影响情况

从不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗根部土壤与桑苗根部Pb含量的影响情况(表4)可以看出：添加不同浓度的CA对桑苗根部土壤Pb含量无显著影响；但添加DTPA、EDTA对盆栽桑苗根部土壤Pb含量有显著影响，其中添加中浓度的DTPA使桑苗根部土壤Pb含量显著高于对照组，添加高浓度的EDTA使桑苗根部土壤Pb含量显著低于对照组。添加3种不同的螯合剂，除了添加高浓度的DTPA使桑苗根部Pb含量显著高于对照组外，其它螯合剂不同浓度处理的桑苗根部Pd含量均无显著差异(表4)。

表4 不同螯合剂不同添加浓度对盆栽桑苗根部土壤与桑苗根部Pb含量的影响情况

3 小结与讨论

随着添加螯合剂浓度的升高，盆栽桑苗叶片的部分指标与对照组相比呈现下降的趋势，尤其是EDTA高浓度组最早出现桑苗止芯、死亡的现象，这表明高浓度的螯合剂会抑制桑苗的生长。这与相关研究结果一致，如有研究表明：随着添加螯合剂[谷氨酸N，N-二乙酸(GLDA)、DTPA]时间的延长(第16天)，在玉米中会出现螯合剂毒性导致生物量大幅下降，最后重金属提取量增高不大甚至大幅下降的情况[10]；添加EDTA在促进苎麻各部分Cd吸收的同时，也会对苎麻的生长产生不利影响[12]；添加较高浓度(7.50 mmol/kg)的EDTA对棉花产生了毒害作用[13]。本文在此基础上检测了各组桑苗叶片中的叶绿素含量、蛋白质含量、MDA含量及抗氧化酶活性，植物通过抗氧化保护酶系统的变化来清除由重金属胁迫造成的自由基失衡，不同螯合剂种类及添加浓度有不同的表现。有研究表明，添加EDTA前期(开始10 d)，地被竹会通过增加SOD、POD、CAT酶活性和可溶性蛋白质含量抵抗Pb胁迫[14]，EDTA的添加还能引起苎麻根系的CAT酶活性急剧下降[7]；此外，移栽50 d后，高浓度的EDTA会导致苎麻叶片中的MDA含量增加[15]。从本文数据中仅能看出添加EDTA、DTPA对重金属污染土壤中栽植的桑苗生长存在影响，如显著降低了桑苗的枝条长度，但桑苗叶片的叶绿素含量、SOD酶活性、CAT酶活性、MDA含量等均未体现出明显差异，数据显示，只有添加DTPA降低了叶片的蛋白质含量，提高了叶片的POD酶活性。不能排除的是，由于试验周期设置太长，导致以上指标的变化未能通过及时检测而明晰。

因为添加螯合剂DTPA与EDTA中浓度(5.00 mmol/kg)和高浓度(10.00 mmol/kg)处理组的桑苗先后出现止芯死亡的现象，桑叶掉落，致使整株桑苗Cd含量的数据不具代表性，所以通过最终分析桑苗根部土壤、桑苗根部Cd、Pb含量的变化来评判螯合剂对桑苗吸收重金属Cd、Pb的影响。有文献表明，随着EDTA施用浓度的增加，土壤中Cd和Pb含量显著降低[15]；施用EDTA处理根际土壤Cd含量与对照相比降低了25%[16]；但在栽植栾树幼苗的盆栽中添加不同浓度的EDTA则发现，EDTA提高了土壤中重金属的解吸能力，在添加90 d后，土壤Cd含量达到最高值，而360 d后土壤中的Pb含量才达到最高值，同时期土壤重金属含量EDTA较低浓度处理(0.25 mmol/kg、0.50 mmol/kg)高于中低浓度处理(2.00 mmol/kg、4.00 mmol/kg)[17]。本文添加低浓度、中浓度的EDTA，土壤中的Cd、Pb含量与对照相比差异不显著，而添加高浓度的EDTA可使根部土壤Cd、Pb含量显著低于对照及低浓度、中浓度处理组数据，且添加不同浓度的EDTA对桑苗根部的Cd、Pb含量无显著影响，推测添加高浓度的EDTA有利于土壤中Cd、Pb被桑苗吸收与向地上部分的转移，从而对桑苗表现出了毒性。

本试验中，随着添加DTPA浓度的增加，根部土壤中Cd含量下降，添加中浓度、高浓度DTPA的根部土壤Cd含量与对照相比达到了显著水平，但桑苗根部的Cd含量没有随着添加DTPA浓度的增加而表现出显著差异，推测中浓度、高浓度的DTPA有利于桑苗对Cd的吸收与Cd向地上部分的转移。桑苗根部土壤中的Pb含量随着添加DTPA浓度的增加与对照相比出现了与Cd含量变化不同的趋势，添加中浓度的DTPA显著增加了根部土壤中的Pb含量，添加低浓度、高浓度的DTPA桑苗根部土壤中的Pb含量与对照相比无显著差异，推测添加中浓度的DTPA有利于土壤中的Pb聚集在桑苗根部，同时添加高浓度的DTPA时桑苗根部的Pb含量显著高于对照组和添加低浓度、中浓度处理组的数据，推测添加高浓度的DTPA有利于桑苗根部对Pb的吸收。

添加CA可提高土壤质量[18]，可以促进苎麻生长，增强苎麻对Cd的吸收和转移，但对Pb的吸收转移效果不显著[19]；也有研究表明CA能有效促进Pb在鱼腥草体内向地上部分转移，对Cd则表现出抑制作用[9]。但在本文中，添加不同浓度的CA对桑苗根部土壤Cd、Pb含量无显著影响，对桑苗根部的Cd、Pb含量也无显著影响。

本试验研究了不同种类、不同浓度螯合剂对土壤与桑苗Cd、Pb含量的影响，结果表明，除CA外，添加中浓度、高浓度的DTPA与高浓度的EDTA时，桑苗根部土壤中的Cd、Pb含量与对照相比变化显著，但考虑添加高浓度的螯合剂会对桑苗的生长产生毒性作用使桑苗死亡，在土壤中添加中浓度的DTPA或许是适合与桑树联合修复污染农田的措施，这还需要后续试验加以验证，通过跟踪监测各数据，结合桑苗生长的不同时期探索施加螯合剂发挥作用的最佳时间，也可考虑在桑苗生长过程中分次添加低浓度的螯合剂，以降低螯合剂的毒性，最大限度地发挥螯合剂的作用。