邓思敬，杜磊，谢静莉*，魏东芝

1(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237)2(华东理工大学 生物工程学院食品科学与工程系，上海，200237)3(华东理工大学 鲁华生物技术研究所，上海，200237)

臭豆腐是传统发酵食品，具有独特的风味及营养价值。臭豆腐通常分为发酵型和非发酵型，由于全国各地饮食习惯各不相同，臭豆腐的制作工艺、香气成分也有较大区别。传统的发酵型臭豆腐卤液通常使用蔬菜及香辛料，以一定的配比自然发酵而成[1]。湖南地区卤液配方以豆豉、纯碱、青矾、香菇等为主，所泡制的豆腐表面呈黑色。而江南一带以绍兴地区为代表的卤液配方则以苋菜梗、生姜、花椒等为主，所泡制豆腐表面呈米白色。卤液发酵过程中，微生物扮演着十分重要的角色，尤其乳酸菌，其组成、含量对卤液风味的形成及营养价值的提升起着决定性的作用[2]。然而，传统臭豆腐卤液的生产往往在敞口的缸或水泥池中，微生物来源于空气等自然环境，存在食品安全隐患的风险[3]。因此，符合食品安全要求，采用明确的菌种，确定的工艺对新鲜原料发酵的生产方式亟待建立[4]。

本课题以绍兴地区风味特征的臭豆腐卤液为对象，运用分离自自然发酵的臭豆腐卤液中的乳酸菌，通过分析菌种的发酵能力、抑菌特性、蛋白水解能力，筛选出适用于卤液生产的乳酸菌菌种，进行多菌株复配发酵，获得一种新型、安全的臭豆腐发酵卤液。采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用的方法对卤液中的香气成分进行分析，为臭豆腐卤液的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苋菜梗、生姜、花椒、豆腐坯，上海清美绿色食品集团；MRS培养基，北京AOBOX生物技术；茚三酮，阿拉丁生化科技股份公司；其余试剂均为分析纯，国药试剂有限责任公司。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱(BS-1E)，常州市凯航仪器有限公司；酶标仪(DNM-9602A)，美国BIOTEK仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪(7890A)，美国Agilent公司；PDMS萃取头(85 μm)，美国Supelco公司；pH计(UB-7)，Denver Instrument；色谱柱(DB-Wax，60 m × 0.25 mm，0.25 μm)，日本岛津实验器材有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌的活化及培养

乳酸菌保藏于-80 ℃甘油管中，16S rDNA测序结果经GenBank核酸序列比对，确定菌株物种归属如表1所示。以体积分数2%接种量接种于MRS液体培养基，37 ℃培养18 h，室温下以4 000 r/min离心15 min，最后用生理盐水悬浮至菌体浓度为107CFU/mL,用于后续发酵。

表1 16S rDNA测序结果比对表Table 1 The results of 16S rDNA sequence

1.3.2 卤液的配制与接种发酵

配制体积分数为2%的无菌盐水，以苋菜梗123 g/L、生姜12.55 g/L、花椒6.3 g/L来配制基础培养基用于卤液的发酵。筛选所得乳酸菌遵循1.3.1方法培养稀释后同比例接种于发酵前培养基中，单菌株发酵或复配乳酸菌发酵液的初始总菌浓均保持为104CFU/mL，并于发酵8 h 时加入体积分数2%的大豆蛋白。

1.3.3 发酵液中总菌浓及总酸度、pH的测定

(1) 菌浓的测定：每隔2 h取发酵液100 μL以无菌生理盐水梯度稀释后于MRS固体培养基(20 g/L琼脂)上涂布培养，每组3个平行，37 ℃恒温倒置培养30 h，读取并确定菌浓。

(2) 酸度的测定：发酵液3 000 r/min，室温离心10 min取上清液，以0.1 moL/L的NaOH溶液滴定。总酸度以100 mL发酵液消耗的NaOH体积表示，1 mL 0.1 moL/L NaOH为1°T。

(3) pH的测定：数字pH计测定。

1.3.4 抑菌作用的测定

活化的菌液用于单菌株卤液发酵，并进行抑菌实验。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌浓为107CFU/mL的活化菌液以20 μL∶30 mL的比例加入融化的LB固体培养基(20 g/L琼脂)中，凝固后牛津杯中分别注入150 mL 待测发酵液，以未经发酵的卤液基底作为对照，37 ℃恒温过夜培养后测量记录抑菌圈。

1.3.5 蛋白水解能力的测定

采用茚三酮比色法进行氨基酸含量的测定。

(1) 茚三酮显色剂的配制：取0.5 g水合茚三酮果糖0.300 g，Na2HPO411.00 g，NaH2PO46.00 g，去离子水溶解并定容至100 mL。

(2) 标准曲线的绘制：甘氨酸以去离子水溶解配制浓度为2～20 mg/L的甘氨酸标准液，取2 mL标准液与3 mL茚三酮显色剂、2 mL PBS缓冲液(pH 5.5)混匀，沸水浴加热30 min后迅速冷却，于570 nm处测定吸光值，所得标准曲线为y=0.039 1x+0.039 3(R2=0.999 1)。

(3) 蛋白水解液中氨基酸含量的测定：在未经发酵的基础培养基中添加碾碎的豆腐坯(40 g/L)作为氮源，分别经乳酸菌水解0、8、24 h后取样,5 000 r/min室温离心10 min，上清液用于蛋白水解度的测定，反应体系同1.3.5(2)所述。

水解度以DH表示,按公式(1)计算:

(1)

式中：h,水解后每克蛋白质被裂解的肽键量，mmol/g；htot,水解度常数，mmol/g。

1.3.6 发酵液香气成分的萃取与分析

取发酵所得臭豆腐卤液产品30 mL、NaCl 5 g、5 μL 0.02 g/L的乙酸苯乙酯于顶空萃取瓶中，磁力搅拌器于50 ℃下80 r/min萃取90 min。PDMS萃取头(85 μm)在进样口250 ℃解吸5 min，每组3个平行。

气相色谱检测条件：采用DB-WAX色谱柱进行气相色谱分析，进样模式为不分流，载气(He)流量1.0 mL/min，升温程序：初始温度40 ℃，保持4 min；以 5 ℃/min升至100 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，在220 ℃保持8 min。

质谱检测条件：离子源温度200 ℃；EI电离源；电子能量为70 eV；检测器为350 V；扫描范围m/z为33～450 amu。

1.3.7 数据分析

结果用平均值±标准差(SD)表示，数据采用SPSS 20.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 单一菌株发酵液抑菌能力的测定

13株实验室乳酸菌菌株经单一菌种发酵所得的臭豆腐卤液,以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对象进行抑菌试验。由表2可知，6株菌株发酵所得卤液在平板上可以观察到明显的抑菌圈，对大肠杆菌或(和)金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌特性。戊糖片球菌2-2、植物乳杆菌1-3、1-1对2种致病菌均有抑制特性，通过对比抑菌圈直径可知1-1菌株抑菌特性最佳；戊糖片球菌2-4、乳酸乳球菌3-1只可单一地抑制大肠杆菌生长，植物乳杆菌3-3只可单一地抑制金黄色葡萄球菌的生长。这证明部分菌株的发酵液对食品中2种较为常见的致病菌具有抑菌性，将其用作臭豆腐卤液发酵菌株可有效解决发酵过程中有害微生物污染的食品安全隐患。

表2 菌株抑菌圈的测定Table 2 Inhibition zones of strain

2.2 乳酸菌蛋白水解能力的测定

臭豆腐发酵卤液中氨基酸含量可用于表征大分子蛋白质被微生物酶系水解程度，水解度越高则豆腐口感越细腻软糯，鲜味成分越多。由图1可知，分离得到的13株乳酸菌均具有不同程度的蛋白水解能力，设置发酵总时长为24 h。在发酵初期蛋白水解度普遍较低，随着时间的延长，植物乳杆菌3-3、乳酸乳球菌3-1和戊糖片球菌2-2的蛋白水解度与发酵时间呈正相关，3-1在24 h时达到12.6%，这是由于乳酸菌在发酵过程中产生蛋白酶及肽酶对大豆蛋白有降解作用[5]。而植物乳杆菌2-1、1-4、1-1、1-2、1-3、戊糖片球菌3-4及发酵乳杆菌2-3的DH值在12 h左右到达顶点；发酵后期(12～24 h)逐渐下降，可能是由于发酵底物被大量消耗，而发酵菌株的代谢产物与其蛋白酶形成复合物，蛋白酶活力被抑制，水解产物可能被细胞再次用于合成自身的蛋白质[9]。

图1 不同菌株发酵液中的蛋白水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of protein in single strain fermented stinky Tofu brine

2.3 乳酸菌发酵能力的测定

以菌株为单一变量进行单菌株卤液发酵。由图2可知，植物乳杆菌1-1、1-2、1-3、3-3发酵能力较好，在发酵前期(0～12 h)呈指数增长并在12～18 h左右生长放缓进入稳定期。植物乳杆菌1-4、2-1及发酵乳杆菌2-3发酵能力差，甚至在发酵后期(18～24 h)菌浓突降，卤液发酵终点菌浓较低。戊糖片球菌4-1、2-2、3-4及乳酸乳球菌3-1发酵能力较好，在发酵前期(0～18 h)呈指数增长,在18 h左右生长放缓进入稳定期。弯曲乳杆菌3-2及戊糖片球菌2-4发酵能力差，卤液发酵终点菌浓较低。

图2 单菌株发酵期间卤液菌浓变化图Fig.2 Variation of bacterial concentration in single strain fermented stinky Tofu brine

2.4 单菌株发酵臭豆腐发酵卤液特征香气成分的分析

13株实验室乳酸菌分别进行单一菌种发酵，所得的臭豆腐发酵卤液以SPME萃取其挥发性香气成分后借助GC-MS检测分析。由表3结果可知，经乳酸菌单菌株发酵后可检测到主要香气成分16种。值得注意的是，部分醇类、酯类、醛类、酮类、酚类以及臭豆腐臭味气息的主要来源吲哚及部分硫醚类物质均在菌株发酵过程中产生。其中植物乳杆菌1-1、植物乳杆菌1-3和乳酸乳球菌3-1发酵产品中醇、酯类挥发性物质丰度较高，可为卤液贡献浓厚、醇香的气味，而戊糖片球菌4-1及戊糖片球菌2-2发酵产品中吲哚及硫醚类物质丰度较高，此类物质为臭豆腐臭味气息的主要来源，将会对香气特征形成产生突出贡献。

表3 单菌株发酵臭豆腐发酵卤液中特征香气成分及其相对含量Table 3 The relative content of volatile compounds of fermented stinky Tofu brine fermented by single strain

2.5 多菌株复配发酵

综合上述分离所得菌株的蛋白水解能力、抑菌能力、发酵能力及单菌株发酵臭豆腐发酵卤液香气成分的实验结果，评级结果如表4所示，筛选出戊糖片球菌2-2、植物乳杆菌1-1、植物乳杆菌1-3、植物乳杆菌3-3、乳酸乳球菌3-1、戊糖片球菌4-1、植物乳杆菌1-2、戊糖片球菌3-4进行混合发酵，分别在0、6、12、18、24 h测定其生长曲线、发酵液酸度、pH值及颜色变化。由图3可知，上述8株菌经混合发酵后发酵能力有所提升，且发酵终点菌浓明显高于单株乳酸菌发酵菌浓，发酵约18 h菌浓达到1013～1014CFU/mL。分析酸度变化后发现，乳酸菌在发酵前期产酸能力较强，pH逐渐下降；发酵后期产酸能力下降，pH上升，发酵终点pH为6.75，每10 mL滴定酸度恢复至8.3°T。酸度过高会引起豆制品变质，并带来令人不愉快的酸涩感，因此豆腐的浸泡应避开酸度较高的6～12 h，选择在24～30 h时投放，由此可减少生产过程中食物变质等不安全因素，便于进行质量控制。与此同时观察到发酵过程中卤液颜色，由初始透明度高的青绿色转变为透明度低的棕色。

表4 筛选条件综合评价Table 4 Comprehensive evaluation of screening conditions

a-复配发酵液菌浓-时间变化; b-复配发酵液pH/酸度-时间变化图3 乳酸菌复配发酵期间卤液菌浓及pH/酸度Fig.3 Variation of bacterial concentration and pH/TA in compound strains fermented stinky Tofu brine

2.6 臭豆腐发酵卤液挥发性香气成分的分析

采用SPME对发酵前原料液、经8株乳酸菌发酵所得及未添加外源菌种自然发酵所得的臭豆腐发酵卤液中的挥发性成分进行萃取，其GC-MS分析的总离子流图如图4～图6所示，共鉴定出挥发性香气成分61种，如表5所示。

表5 臭豆腐发酵卤液挥发性香气成分及其相对含量Table 5 The relative content of volatile compounds of fermented stinky Tofu brine

图4 未发酵卤液挥发性香气成分的GC-MS图谱Fig.4 GC-MS chromatogram of stinky Tofu brine before fermented by compound strains

图5 发酵后臭豆腐卤液挥发性香气成分的GC-MS图谱Fig.5 GC-MS chromatogram of stinky Tofu brine after fermented by compound strains

图6 自然发酵所得臭豆腐卤液挥发性香气成分的GC-MS图谱Fig.6 GC-MS chromatogram of stinky Tofu brine after natural fermentation

由实验结果可知，鉴定出的挥发性香气成分包含烯烃类19种、醇类12种、酯类8种、酸类5种、醛类3种、酮类4种、其他(包括胺类、硫醚类、吲哚、酚类等)10种。贺静等分析臭豆腐卤液发酵过程中的挥发性香气成分相对含量较高的有醇类、酮类、酯类、醛类等[6]，与本实验一致。

2.6.1 醇、酯类

醇类物质在发酵过程中丰度普遍上升，与未添加外源菌种的自然发酵产品相比，其丰度及种类均有所增加，且较之单菌株发酵产品总体丰度显著提高。差别较为显著的有正丁醇及芳樟醇，它们可以赋予卤液醇厚香气，构成其重要的香气特征[8]。刘玉平等[9]及郑小芬等[7]均报道了臭豆腐的香气中有高丰度的正丁醇。

本混合菌株发酵卤液中酯类物质除乙酸丁酯外均由发酵产生，其中对香气生成贡献明显的有乙酸丁酯、乙酸己酯和戊酸乙酯，较之单菌株发酵产品种类显著增多。自然发酵产品中酯类物质仅有2种且丰度较低。酯类物质多为果木香和甜香香气，乳酸菌可利用有机酸和醇通过非酶催化的酯化反应生成[10]。万力婷等[11]也曾报道在发酵苋菜梗过程中检测到丰度较低的酯类物质，由于酯类化合物芳香阈值极低，低丰度情况下仍是卤液特征香气的重要组成[12]。

2.6.2 酸类

混合菌株发酵卤液中酸类物质大部分在发酵过程中丰度降低甚至消失，总丰度极低，而在自然发酵产品中其相对丰度较高。酸类物质往往会呈现令人不愉快的酸败气味，对感官产生不良影响，筛选出的8株乳酸菌进行规范化发酵对此现象有良好的抑制作用，有助于优化产品风味。

2.6.3 醛、酮类

醛类物质在发酵前原料液中未检测到，其均为混合菌株发酵过程中产生。而自然发酵产品中醛类物质仅有柠檬醛一种且丰度极低，且较之单菌株发酵产品其丰度显著提升。有研究表明，苋菜梗只有在发酵过程中才会检测到醛类物质[12]，与本实验结果类似。混合菌株发酵卤液中鉴定所得酮类物质共3种，较自然发酵和单菌株发酵卤液其丰度、种类均有明显提升，3-辛酮具果实香气，对卤液香气特征有重要影响。

2.6.4 其他

混合发酵液中可被鉴别的其他类别的物质大部分在发酵过程中产生。其中丙胺具有氨气味，硫醚类物质由乳酸菌降解含硫氨基酸得到，含硫化合物对于食物香气特征有着本质贡献。吲哚经微生物降解氨基酸产生，在发酵卤液中丰度很高，有强烈的粪臭味气息，其芳香阈值很低, 为卤液重要的特征香气成分。混合发酵卤液中吲哚相对丰度(27.91%)较单菌株发酵卤液有明显增加，卤液香气特征更为鲜明。贺静等报道卤液发酵原料中未检测到吲哚，而发酵过程中吲哚始终存在[13]，为臭豆腐发酵卤液特有成分；刘玉平等[14]、孙洁雯等[15]及郑小芬等[7]也检测到较高丰度吲哚的存在。

综上所述，臭豆腐卤液香气特征的形成与乳酸菌发酵过程密切相关，发酵原料在微生物的代谢过程中生成香气成分或将其转化。经分析可初步判断，本实验中臭豆腐发酵卤液的主体香气成分为2-蒈烯、γ-松油烯、正丁醇、桉树醇、芳樟醇、乙酸丁酯、乙酸己酯、戊酸乙酯、柠檬醛、橙花醛、3-辛酮、2-十三烷酮。臭豆腐发酵卤液的典型香气成分为二甲基二流醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚和吲哚。

3 结论

本课题以实验室前期从自然发酵的臭豆腐卤液中分离得到13株乳酸菌为研究对象，通过评价其发酵能力、抑菌活性、蛋白水解能力以及对发酵臭豆腐卤液香气形成的贡献作用，优选其中8株复配并进行臭豆腐卤液的发酵。该发酵菌种配方具有菌种来源明确、发酵周期短、蛋白水解能力强、具有抑菌活性等显著优点，既可以有效预防传统发酵食品生产过程中存在的食品安全隐患，同时可以获得营养丰富，品质稳定的发酵产品。采用GC-MS分析发酵卤液中的挥发性香气成分，共鉴定得到61种。通过归类分析可知本实验中臭豆腐发酵卤液的典型香气成分为二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚和吲哚。对比文献可知,乳酸菌发酵的臭豆腐发酵卤液产品香气特征与传统发酵臭豆腐卤液相仿，可以替代传统发酵方式，为传统食品的工业化生产提供了理论依据。

续表5