杜丽红，熊海波，徐达，徐庆阳,2，陈宁,2*

1(天津科技大学 生物工程学院，天津，300457)2(代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津，300457)

谷氨酸棒状杆菌为一种重要的工业化生产氨基酸的细胞工厂[1]，早期谷氨酸棒状杆菌的修饰得益于随机化学或紫外DNA的突变，虽然得到的菌株可大量积累氨基酸[2-3]，但是性状不稳定和生长缺陷是菌株常常面临的问题[4-5]。随着分子生物学和全基因组测序的发展，基因编辑技术包括转座子修饰、同源重组、靶点基因的缺失或过表达[6-8]。但是精准的基因编辑仍依赖于自杀载体系统，在编辑过程中，需要通过二次重组将载体丢失得到无质粒菌株，编辑效率低下是自杀载体系统一直存在的问题[9]。随着CRISPR/Cas9技术的流行，依赖于该技术且应用于谷氨酸棒状杆菌的CRISPR-Cpf1技术得到发展[10-11]，同时以pK18mobsacB为基础进行优化得到的链霉素筛选系统也被提出[12]。

在氨基酸生产菌株构建中，基因缺失是改变胞内代谢流向的常用手段[13]，但是生长缺陷也是基因缺失常见的负向效应之一，因此很难分析并确定这些基因在氨基酸生产中的作用，特别是以维持细胞正常代谢生长的中间代谢物为合成前体物的氨基酸。L-缬氨酸生产菌株的选育经历了传统诱变到微生物发酵生产的演变[14-16]。随着生物技术的发展，L-缬氨酸的合成及代谢途径得到全面深入的研究，谷氨酸棒杆菌中丙酮酸是L-缬氨酸需要的唯一前体物质，同时也是进入TCA循环维持细胞正常代谢的重要中间代谢物[17]，经分子生物学修饰来保证更多的丙酮酸流向L-缬氨酸合成途径是细胞大量积累L-缬氨酸的有效方式[18-20]。同时L-缬氨酸积累过程中需大量的NADPH来提供还原力[21]，而磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)是为细胞提供还原力的主要途径。无论是对丙酮酸相关途径还是对PPP途径进行修饰，都会带来细胞生长缓慢的问题，因此L-缬氨酸的高效积累同细胞生长之间存在着紧密的联系。

为能探究与丙酮酸代谢和PPP途径相关的基因在L-缬氨酸生产中的作用，找到利于L-缬氨酸积累的高效修饰靶点，本研究构建了一套应用于谷氨酸棒状杆菌的双质粒CRISPRi干扰技术，利用此干扰技术对部分基因进行不同程度的干扰，以细胞生长和L-缬氨酸积累为衡量指标，最终确定L-缬氨酸生产菌株构建中重要的修饰靶点，并为促进L-缬氨酸积累提供了有效的修饰方向。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的菌株及质粒如表1所示。

表1 本研究所用的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 重组菌株的构建方法

基因ilvBNXV和pntAB的整合应用pK18mobsacB系统，所用重要引物如表2所示。

表2 实验所用引物Table 2 Primers used in the study

1.3 重组质粒的构建

选择双酶切技术将质粒线性化，利用PCR技术获得目的片段，线性载体和目的片段均得到后，利用同源重组试剂盒进行重组质粒的构建，重组体系见表3。

表3 同源重组体系Table 3 The homologous recombination system

1.4 培养基

斜面培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，玉米浆液15 mL/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L，柠檬酸2 g/L，琼脂粉15 g/L。

种子培养基：葡萄糖25 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米浆液15 mL/L，(NH4)2SO410 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，MnSO42 mg/L，FeSO42 mg/L，VB10.3 mg/L，VH0.2 mg/L，VB120.2 mg/L，苯酚红2%。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米浆液20 mL/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，MnSO430 mg/L，FeSO430 mg/L，VB10.5 mg/L，VH0.3 mg/L，VB120.2 mg/L，苯酚红2%。

1.5 培养条件

斜面培养条件：接种环刮取保菌管中的菌液1环并划线于斜面培养基中，将其放置于32 ℃培养箱中恒温孵育培养20～24 h。

摇瓶种子培养：用接种环将斜面培养基中菌体轻轻刮起，转接于提前灭菌的种子培养基，置于32 ℃摇床中振荡培养，200 r/min，培养12～18 h。

摇瓶发酵培养：用提前灭菌的5 mL移液管吸取3 mL种子培养液，转接于提前灭菌的发酵培养基中，继续放于32 ℃摇床中振荡培养，200 r/min，培养过程中以苯酚红为指示剂，通过颜色变化来流加氨水控制pH，发酵至24 h结束发酵。

1.6 发酵参数测定方法

利用分光光度计测定新鲜发酵液600 nm处的吸光值，并以此来表征发酵过程中菌体浓度，以OD600来表示；利用高效液相分析系统测定发酵液中目的产品L-缬氨酸浓度。Agilent Cl8(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)为检测柱，样品利用2，4-二硝基氟苯进行衍生，流动相为体积分数为50%的乙腈与50 mmol/L的乙酸钠水溶液，进行梯度洗脱，洗脱配比如表4，柱温33 ℃，流动相流量1 mL/min，检测波长360 nm。

表4 二元梯度洗脱表Table 4 A two-element system composed of acetonitrile and sodium acetate

1.7 相对转录水平的测定

见参考文献[22]。

2 结果与讨论

2.1 干扰质粒的构建

以质粒pECXK99E为dcas9的表达载体，以pXMJ19质粒为gRNA的表达载体，按照1.3中重组质粒构建方法构建两个重组质粒，结果如图1。

图1 干扰质粒的构建Fig.1 Construction of interference plasmids

利用常规的重组质粒构建方法成功构建了pECXK99E-dcas9。在进行pXMJ19-gRNA重组质粒的构建时，选择了3种不同的方案：(1)将pXMJ19进行单酶切并线性化，将根据靶点基因设计的20 bp识别序列分别加在引物的5’端，利用重叠PCR技术将其加入gRNA构件中，再利用同源重组技术将得到的包括gRNA、回文重叠序列、终止子和tracer RNA的目的片段与线性化质粒进行重组得到pXMJ19-gRNA质粒；(2)将pXMJ19进行双酶切并线性化，同时将大肠杆菌CRISPRi系统中的酶切位点BSPQI引入目的片段中，将带有BSPQI酶切位点的目的片段同线性化质粒重组，得到不带有靶点基因识别序列重组质粒后，利用BSPQI酶将该质粒线性化，并再次经同源重组将靶点基因的识别序列同线性化质粒连接，得到最终的pXMJ19-gRNA质粒；(3)双酶切将质粒pXMJ19线性化，将根据靶点基因设计的20 bp识别序列分别加在引物的5’端，利用重叠PCR将其加入gRNA构件中，再利用同源重组将得到的包括gRNA、回文重叠序列、终止子和tracer RNA的目的片段与线性化质粒进行重组得到质粒。3种方案中，方案二理论上为省时高效的实施手段，但是在具体操作时，将3个方案分别得到的10株转化菌株提取质粒送至金唯智公司测序，发现方案一和方案二中均没有成功重组的质粒，而方案三中阳性质粒的概率为80%，因此在后续工作中，选择方案三进行pXMJ19-gRNA质粒的构建。

2.2 干扰系统的验证

为验证2.1中构建的干扰系统是否能够成功发挥作用，选择GFP为报告基因，并以gfp的非编码链DNA序列为模板，分别在启动子区域、翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG区域)和远离ATG 200 bp的下游区域寻找干扰靶点，构建3个gfp干扰质粒，并分别电转入带有pECXK99E-dcas9的菌株中。将得到的菌株进行摇瓶培养，发酵进行至12 h取样，测定不同菌株中GFP的相对荧光强度，同时以带有pECXK99E-dcas9和pXMJ19两个质粒的菌株为对照组，结果如图2。

通过结果可以看出，对gfp不同区域进行干扰时，GFP的相对荧光强度出现了明显的差异。对gfpDNA序列的启动子区域进行干扰时，GFP的相对荧光强度最低，对远离ATG 200 bp的下游区域进行弱化时，同未被弱化的GFP差异较小，表明利用本研究中构建的双质粒干扰系统对基因gfp的转录水平成功进行了干扰弱化，且选择的3个干扰区域可实现对靶点基因的不同弱化水平。因此在对L-缬氨酸相关途径进行弱化时，同样选择靶基因DNA序列非编码链的启动子区域、翻译起始区域和远离ATG 200 bp的下游区域3个位点进行靶基因的弱化表达实验。

GP0-对照菌株; GP1-弱化gfp启动子区域; GP2-弱化gfp翻译起始区域; GP3-弱化gfp远离ATG区域图2 不同干扰方式对基因gfp相对荧光强度的影响Fig.2 Effect of different interference strategies on relative fluorescence intensity of gfp

2.3 L-缬氨酸生产菌株的构建

L-缬氨酸生物合成途径中，唯一一个限速反应由乙酸乳酸合酶(AHAS)催化进行，但是此酶受到L-缬氨酸的反馈抑制，因此在L-缬氨酸生产菌株的构建中，首要任务是解除L-缬氨酸对AHAS的反馈抑制并进行上调表达。为获得可初步积累L-缬氨酸的菌株，以本实验室保存的经传统诱变得到的L-缬氨酸生产菌株XV的基因组DNA为模板，对已经成功解除反馈抑制的AHAS编码基因ilvBN进行扩增，利用pK18mobsacB技术，将Ptuf-ilvBNXV整合至谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032pqo位点，得到菌株A01，同时为进一步强化A01积累L-缬氨酸的能力，选择将基因Ptuf-ilvBNXV双拷贝至A01的Cgl1890位点，得到菌株A02。对菌株A01、A02进行摇瓶培养实验，同时以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为对照组，结果如图3。

ATCC 13032-对照菌株; A01-Ptuf-ilvBNXV::pqo; A02-Ptuf-ilvBNXV::pqo Ptuf-ilvBNXV::Cgl1890图3 不同菌株摇瓶发酵结果Fig.3 Shaking flask fermentation results of different strains

从图3可以看出，ilvBNXV的强化表达，促进了L-缬氨酸的初步积累，双拷贝菌株的L-缬氨酸产量可达31.2 g/L，较单拷贝菌株的产量提高了近1倍，同时其他2种支链氨基酸L-亮氨酸和L-异亮氨酸的积累浓度很低，因此选择菌株A02作为可积累L-缬氨酸的基础菌株，利用CRISPRi系统进行多个位点的干扰实验。

2.4 aceE、gltA和kgd的弱化

因丙酮酸是L-缬氨酸合成所需的唯一前体物，因此增强丙酮酸的供应是再次提高菌株A02积累L-缬氨酸能力的关键。但是在微生物胞内，丙酮酸是重要的中心代谢物之一，其主要去向是经乙酰coA进入TCA循环，维持细胞正常生命活动。此外，丙酮酸是胞内代谢网络的刚性节点，对丙酮酸相关途径的修饰对胞内代谢有着明显的影响，因此L-缬氨酸的积累同细胞生长之间存在着紧密联系。为能在保证细胞正常生长的同时，将更多的丙酮酸流向L-缬氨酸合成途径，利用本研究构建的双质粒干扰系统对丙酮酸代谢相关靶点基因的转录水平进行弱化实验。首先利用电转化实验将pECXK99E-dcas9质粒转化入菌株A02，得到A03菌株，根据不同基因的启动子区域、翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG区域)和远离ATG 200 bp三个区域设计弱化靶点，构建不同的pXMJ19-gRNA质粒并分别电转入菌株A03得到不同的菌株后，进行了摇瓶实验，发酵进行至8 h，添加0.2 mmol/L的IPTG对干扰质粒进行诱导表达，并对L-缬氨酸浓度和靶点基因的转录水平进行了测定，同时以带有pECXK99E-dcas9和pXMJ19质粒的菌株A030为对照组，结果如图4。

由图4可知，在对aceE、gltA和kgd三个靶点基因进行不同区域干扰弱化时，3个靶点基因相对转录水平均出现了明显的差异。在对3个基因的启动子区域进行弱化时，3个基因的相对转录水平出现了明显的下降，且均低于0.15；对翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG区域)进行干扰时，3个基因的相对转录水平均低于0.5；而对远离ATG区域进行干扰时，3个基因的相对转录水平均在0.7以上。通过测定L-缬氨酸浓度发现，基因aceE的干扰效果对促进L-缬氨酸的积累有着明显的正向效果，在对启动子区域进行弱化时，基因aceE的相对转录水平过低，细胞因TCA循环受阻出现了生长缓慢的问题，产量在30.1 g/L，而对翻译起始区域进行干扰时，L-缬氨酸的积累浓度达34.6 g/L，较对照菌株提高了6.1 g/L，表明对丙酮酸主要代谢途径的弱化节省的部分丙酮酸成功进入了L-缬氨酸的合成途径。但是在对gltA和kgd进行干扰实验时，对L-缬氨酸的积累没有明显的促进的作用。结果表明在L-缬氨酸生产菌株的构建中，直接决定丙酮酸去向的基因aceE是一个重要的修饰靶点，而TCA循环中的相关基因的弱化不会带来明显的效果。

图4 不同干扰位点对菌株A03摇瓶发酵产L-缬氨酸的影响Fig.4 Effects of different interference sites on L-valine production

2.5 PPP途径的弱化

除弱化丙酮酸向TCA的代谢以外，通过弱化葡萄糖向PPP途径的代谢，也可以在一定程度上增加糖酵解途径的碳源分配进而增加流向L-缬氨酸合成途径的代谢流量。因胞内PPP途径是为细胞提供还原力的主要途径，因此在对PPP途径进行弱化时首先要解决L-缬氨酸合成所需还原力NADPH供应的问题。在对PPP途径进行弱化前，首先强化了可根据细胞内NADH/NADPH需要而实现两者相互转化的基因pntAB，并保证该基因受到较强启动子sod的转录调控。在基因pntAB得到强化后，对PPP途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Cgl1576编码)进行了干扰弱化，结果如图4。对3个不同区域进行干扰时，基因Cgl1576的转录水平出现了明显的差异，对启动子区域进行干扰时，虽然靶基因的转录水平最低，约为正常水平的0.19，但是L-缬氨酸的产量没有因更多碳源流入EMP途径而提高；对翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG附近)进行干扰是3组实验中效果最为明显的修饰手段，L-缬氨酸浓度可达32.3 g/L；对远离ATG区域进行弱化时，L-缬氨酸的浓度没有明显提升。结果表明，对PPP途径进行弱化来提高EMP途径的代谢通量也可提高细胞积累L-缬氨酸的能力。

如表5所示，在对糖酵解和TCA途径中多个基因进行修饰时，发现只有对aceE进行弱化时才会明显促进L-缬氨酸的积累，而对基因gltA和kgd的弱化没有表现出明显的正向效应；对PPP途径中Cgl1576的弱化同样会促进L-缬氨酸的积累。因此，在L-缬氨酸生产菌株的构建中，弱化直接决定丙酮酸去向的基因和同糖酵解途径竞争碳源的PPP途径是有效的修饰手段。

表5 不同修饰靶点对L-缬氨酸产量的影响Table 5 Effects of different modified targets on L-valine production

2.6 aceE和Cgl1576的同时弱化

根据以上的实验结果，发现无论是对丙酮酸相关途径还是对PPP途径的弱化，都起到了明显效果。为能保证更多的碳源流向糖酵解途径，同时糖酵解产物丙酮酸及时流向L-缬氨酸合成途径，尝试同时对aceE和Cgl1576的转录水平进行干扰弱化。对aceE的弱化方式选择对翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG区域)的弱化，在此基础上对PPP途径进行修饰时选择了2.5小节中对基因Cgl1576的弱化方式并对得到的菌株进行了验证，在摇瓶培养至16 h时添加作用浓度为0.2 mmol/L的诱导剂IPTG，保证弱化质粒发挥作用，32 h结束发酵并测定发酵液中的L-缬氨酸的浓度。

A0300-对照菌株; A0301-同时弱化aceE翻译起始区域和Cgl1576启动子区域; A0302-同时弱化aceE翻译起始区域和Cgl1576翻译起始区域; A0303-同时弱化aceE翻译起始区域和Cgl1576远离翻译起始区域图5 不同弱化组合方式对L-缬氨酸积累的影响Fig.5 Effects of different weakening combination on L-valine accumulation

如图5所示，同时对EMP和PPP途径进行修饰来积累更多的丙酮酸，进而提高细胞积累L-缬氨酸的能力取得了明显的成果，在对aceE的翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG区域)弱化的基础上，对Cgl1576的启动子区域进行干扰时，2个基因的转录水平受到了严重的弱化，维持细胞正常生长和为细胞供能的两个代谢途径也受到了阻碍，细胞生长缓慢，积累L-缬氨酸的能力也随之下降；而对Cgl1576其他2个区域的弱化均有利于L-缬氨酸的积累，其中对翻译起始区域弱化得到的菌株A0302是所有实验组中最具潜力的菌株，可积累L-缬氨酸37.1 g/L。

3 结论

丙酮酸是L-缬氨酸生物合成所需的唯一前体物，同时是细胞内重要的刚性节点，因此在L-缬氨酸大量积累的同时，维持细胞正常生长是L-缬氨酸生产菌株构建中一直存在的瓶颈。本研究建立了应用于谷氨酸棒状杆菌的诱导型CRISPRi技术并成功应用到L-缬氨酸生产领域，不仅保证了细胞的正常生长，而且实现了对靶点基因时空上的灵活调控。通过对TCA循环和PPP途径中的多个基因的转录水平进行调控，确定了能明显促进L-缬氨酸积累的关键靶点和弱化方式，关键靶点包括aceE编码的丙酮酸脱氢酶亚基E1和由Cgl1576编码的六磷酸葡萄糖脱氢酶，分别对两个基因的翻译起始区域(DNA序列中起始密码子ATG区域)进行弱化是最佳的调控方式，得到菌株A03E2和A0362可分别积累L-缬氨酸34.6 g/L和32.3 g/L，较对照菌株A0300提高了6.1 g/L和3.8 g/L。为能得到更理想的代谢流分配，对aceE和Cgl1576两个基因同时进行了弱化实验，并对多种不同组合方式进行了验证，最终确定同时对两个基因的翻译起始区域，即DNA序列中起始密码子ATG区域，进行弱化时效果显著，得到的菌株A0302可积累L-缬氨酸37.1 g/L，为所有实验组中最高的产值。研究中靶点基因的修饰策略为以后L-缬氨酸生产菌株的构建提供了思路和方向。