张爱梅,郭保民,韩雪英,李曦冉

1 西北师范大学生命科学学院, 兰州 730070 2 玉门市第一中学, 玉门 735200

植物内生菌是指生活在健康植物的不同器官和组织内,并与宿主植物能够建立和谐共生关系的一类微生物[1]。植物内生菌广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实和种子中,具有丰富的多样性[2]。作为植物的繁殖器官,种子在植物性状和品质传承中发挥着重要作用。种子可作为多种有益细菌和病原菌的载体,已有研究证实植物种子内部携带有丰富的微生物种群[3]。在植物种子萌发和发育过程中,种子内生菌还能产生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid),直接促进种子的生长,此外,种子内生菌具有溶磷和固氮作用,能促进种子对磷和氮元素的吸收利用,有效提高种子萌发率、幼苗存活率和生物量积累等[4-5]。

中国沙棘(Hippophaerhamnoidessubsp.sinensis)是胡颓子科沙棘属的灌木或小乔木,广泛分布于干旱、半干旱地区,根系发达。其根部由于弗兰克氏菌的侵染,能形成明显的根瘤[6-7]。现有研究也表明,中国沙棘内生菌有着丰富的组织多样性,沙棘内生菌不仅存在于其根瘤中[8],还存在于其根、茎和叶等组织中[9],且在这些组织中的内生菌还具有丰富的种类多样性。但是,关于中国沙棘种子内生菌的研究还鲜有报道,为了深入了解中国沙棘种子内生细菌的多样性,明确沙棘种子内生细菌的群落结构组成及特点,本研究以分布在甘肃榆中县和秦安县的野生中国沙棘为材料,收集其种子,采用纯培养技术和高通量测序技术,研究中国沙棘种子内生细菌的多样性,获得具有潜在应用价值的种子内生细菌资源。以期探究两种不同生境的中国沙棘种子内生细菌多样性差异,为沙棘种子内生细菌多样性的研究与应用提供参考,并为更进一步开展种子内生细菌相关研究提供有价值的菌株材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1采样地概况

于2017年9月,在甘肃省榆中县马衔山(样品编号为A)和秦安县王铺乡(样品编号为B)两个典型的野生中国沙棘灌丛居群中,以五点取样法分别选取树龄基本相同的野生中国沙棘,采集树上成熟的果实,剥去果肉后,选择颗粒圆润、饱满的种子作为实验材料,样地信息详见表1。

表1 中国沙棘样地信息

榆中县马衔山样地地处北纬35°46′、东经103°57′,海拔为2791 m,样地为石质山地林区；秦安县王铺乡样地地处北纬35°05′、东经105°23′,海拔为1960 m,样地为黄土梁地形；两样地均为黄土高原高寒阴湿区,采样地分布有大量的野生中国沙棘。榆中县马衔山和秦安县王铺乡两样地海拔、年降水量和年均气温存在较大差异,土壤类型和pH等环境因子差异均较小。

1.1.2主要设备与试剂

高压蒸汽灭菌锅(DSX-280B),上海博迅实业有限公司；超净工作台(5W-CJ-2FD),苏州安泰空气技术有限公司；凝胶成像仪(JS780),Bio-Rad公司；PCR仪(EPC-810),东胜创新生物科技有限公司；电泳仪(DYY-12),北京六一生物科技有限公司；恒温震荡摇床(H2Q-F160A),上海一恒科学仪器有限公司；高速台式离心机(TG20-WS),湖南湘立科学仪器有限公司；电热恒温培养箱(DHP-9080B),上海琅玕实验设备有限公司。

PCR扩增引物,北京奥科鼎盛生物科技有限公司；2×ES Taq MasterMix,康为世纪生物科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂等(北京奥博星生物技术有限责任公司)。

1.2 实验方法

1.2.1沙棘种子内生细菌的纯培养

(1)沙棘种子可培养内生细菌的分离与纯化

称取1 g沙棘种子样品于10 mL 离心管中,加5 mL 75%酒精浸泡1 min,再加5 mL 5%次氯酸钠浸泡5 min,最后用无菌水冲洗3次,置于无菌滤纸上,吸干残水备用[10]。将已消毒的种子研磨后加5 mL无菌水稀释,吸取150 μL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基,同时吸取150 μL洗涤水(消毒后第3次冲洗种子后的无菌水)为对照组检验表面消毒效果,涂布后置于37℃条件下培养72 h,每处理3组平行。待平板中长出菌落后,根据颜色、大小、形状等的不同挑取单菌落平板划线纯化,将纯化后得到的菌株编号,并斜面保存于4℃冰箱。

(2)沙棘种子内生细菌的形态鉴定

对分离纯化得到的内生细菌菌株进行菌落形态和显微形态观察,形态特征观察主要参考《常见细菌系统鉴定手册》[11]。

(3)沙棘种子内生细菌的分子鉴定

沙棘种子内生细菌DNA的提取采用碱裂法[12]。PCR扩增采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTA-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。反应体系为25 μL∶1 μL 27F,1 μL 1492R,15 μL Taq聚合酶,4 μL ddH2O,4 μL模板。反应条件：94℃ 2 min,94℃ 1 min,56℃ 30 s,72℃ 1 min；30个循环,72℃ 2 min[13]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。所得序列信息提交NCBI数据库进行BLAST同源性比对,选取相似性最大的序列,用MEGA7.0软件进行同源性分析,然后以邻接法[14]构建系统发育树。

1.2.2沙棘种子内生细菌的高通量测序

种子消毒处理同方法1.2.1。沙棘种子内生菌总DNA的提取采用CTAB法[15],以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度[16]。采用带Barcode的特异引物扩增16S rDNA-V5区。扩增体系30 μL：Phusion Master Mix(2×)15 μL,Primer(2 μmol/L)3 μL,gDNA(1 ng/μL)10 μL,ddH2O 2 μL。反应程序：98℃ 1 min,98℃ 10 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,30个循环；72℃ 5 min,PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测[17-18]。PCR扩增产物送北京诺禾致源科技股份有限公司,由Illumina Miseq测序仪进行高通量测序,首先对PCR产物进行混样与纯化,然后进行文库构建和上机测序,测序得到的原始数据(Raw Data),存在一定比例的干扰数据(Dirty Data),为了使信息分析的结果更加准确、可靠,首先对原始数据进行拼接、过滤,得到有效数据(Clean Data)。然后基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类。为研究各样本的物种组成,对所有样本的Effective Tags,以97%的一致性(Identity)进行OTUs聚类,然后对OTUs的代表序列进行物种注释并进行生物学分析。

2 结果与分析

2.1 榆中县中国沙棘种子内生细菌多样性

2.1.1榆中县中国沙棘种子内生细菌的纯培养

(1)内生细菌的形态特征

从榆中县中国沙棘种子中共分离得到4株内生细菌,编号分别为YZ1709B01、YZ1709B02、YZ1709B03、YZ1709B04。4株菌菌落表面均为湿润光滑状,菌落颜色呈乳白色,菌落形态为圆形或点状。除菌株YZ1709B04为革兰氏阴性菌外(图1),其余3株菌均为革兰氏阳性菌,其中,菌株YZ1709B01和YZ1709B03为杆状菌,菌株YZ1709B02和YZ1709B04为球状菌。

图1 菌株YZ1709B04的形态特征

(2)内生细菌的16S rRNA基因序列分析

对纯培养分离得到的内生细菌,提取其DNA后,PCR扩增其16S rRNA基因序列并进行测序分析,以邻接法构建系统发育树(图2)。经16S rRNA基因序列和系统发育分析结果表明：4株中国沙棘种子内生细菌中,3株属于厚壁菌门(Firmicutes),其中2株为芽孢杆菌属(Bacillus),1株为葡萄球菌属(Staphylococcus)。另外1株属于变形菌门(Proteobacteria)的假单胞菌属(Pseudomonas)。

图2 基于16SrRNA基因构建系统发育树

2.1.2榆中县中国沙棘种子内生细菌的高通量测序

提取榆中县中国沙棘种子内生细菌总DNA,经检测合格后,进行PCR扩增,扩增产物用于文库构建和上机测序,然后基于有效数据对OTUs的代表序列进行物种注释分析。

(1)样品复杂度分析及OTUs数目统计

测序共得到71080条原始序列,经过滤后得到64452条有效序列,可分为147个OTUs。序列平均长度为368 bp,有效率为90.68%。从序列的分布长度来看,与16S rDNA-V5区序列长度大致吻合,表明测序数据量合理,可以反映样品中绝大多数的微生物信息。

(2)内生细菌群落结构组成

经高通量测序后,选取相对丰度前10位的物种,在门和属水平进行统计分析。从门水平看,沙棘种子内生细菌主要分布在7个菌门。由图3可看出,内生细菌的主要优势门是蓝藻门(Cyanobacteria),其相对丰度为95.62%。变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)在榆中县沙棘种子中均有分布,相对丰度依次为2.03%、0.31%、0.22%、0.20%、0.01%和0.01%；其他门类的相对丰度合计为1.61%。

从属水平看(图3),榆中县中国沙棘种子内生细菌的主要优势菌属是蓝细菌属(Cyanobacteria)和贪噬菌属(Variovorax),相对丰度分别为95.09%和0.63%。此外,甲基杆菌属(Methylobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、气单胞菌属(Aureimonas)、红树杆菌属(Mangrovibacter)、欧文氏菌属(Erwinia)和马赛菌属(Massilia)在沙棘种子中均有分布,相对丰度依次为0.27%、0.26%、0.19%、0.12%、0.11%、0.09%、0.08%和0.07%；其他菌属的相对丰度合计为3.09%。

2.2 秦安县中国沙棘种子内生细菌多样性

2.2.1秦安县中国沙棘种子内生细菌的纯培养

(1)内生细菌的形态特征

从秦安县中国沙棘种子中共分离得到5株内生细菌,编号分别为QA1709B01、QA1709B02、QA1709B03、QA1709B04和QA1709B05。5株菌菌落表面均为湿润光滑状,菌落颜色呈乳白色,菌落形态为圆形或点状。除菌株QA1709B04为革兰氏阴性菌外,其余4株菌均为革兰氏阳性菌,且5株菌均为杆状菌(图4)。

图4 菌株QA1709B01的形态特征

(2)内生细菌的16S rRNA基因序列分析

对纯培养分离得到的内生细菌,提取其DNA后,PCR扩增其16S rRNA基因序列并进行测序分析,以邻接法构建系统发育树(图5)。经16S rRNA基因序列和系统发育分析结果表明：5株中国沙棘种子内生细菌中,4株属于厚壁菌门(Firmicutes),其中3株为芽孢杆菌属(Bacillus),1株为葡萄球菌属(Staphylococcus)。另外1株属于变形菌门(Proteobacteria)的不动杆菌属(Acinetobacter)。

图5 基于16S rRNA基因构建系统发育树

2.2.2秦安县中国沙棘种子内生细菌的高通量测序

提取秦安县中国沙棘种子内生细菌总DNA,经检测合格后,进行PCR扩增,扩增产物用于文库构建和上机测序,然后基于有效数据对OTUs的代表序列进行物种注释分析。

(1)样品复杂度分析及OTUs数目统计

测序共得到82254条原始序列,经过滤后得到80073条有效序列,可分为75个OTUs,序列平均长度为372 bp,有效率为97.35%。从序列的分布长度来看,与16S rDNA-V5区序列长度大致吻合,表明测序数据量合理,可以反映样品中绝大多数的微生物信息。

(2)内生细菌群落结构组成

经高通量测序后,选取相对丰度前10位的物种,在门和属水平进行统计分析。从门水平看,沙棘种子内生细菌主要分布在5个菌门。由图6可看出,内生细菌的主要优势门类是变形菌门(Proteobacteria),其相对丰度为91.68%。蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)在秦安县沙棘种子中均有分布,相对丰度依次为8.06%、0.04%、0.01%和0.01%；其他门类的相对丰度合计为0.20%。

从属水平看(图6),秦安县中国沙棘种子内生细菌的主要优势菌属是寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),相对丰度为85.60%,其次是蓝细菌属(Cyanobacteria)和叶杆菌属(Phyllobacterium),相对丰度为7.86%和5.28%。此外,代尔夫特菌属(Delftia)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)、马赛菌属(Massilia)、嗜酸菌属(Acidiphilium)在秦安县中国沙棘种子中均有分布,相对丰度依次为0.24%、0.05%、0.03%、0.02%、0.01%、0.01%和0.01%；其他菌属的相对丰度合计为0.88%。

图6 秦安县中国沙棘种子内生细菌在门和属水平上的物种组成和相对丰度

2.3 榆中县和秦安县两种不同生境中国沙棘种子内生细菌多样性比较

2.3.1内生细菌纯培养的差异

纯培养研究结果表明,从榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子中分离纯化得到的内生细菌种类有一定的差异。其中,从榆中县和秦安县中国沙棘种子中分别分离纯化得到4株和5株内生细菌(表2)。在门分类水平,榆中县中国沙棘种子内生细菌中有3株属于厚壁菌门,1株属于变形菌门；而秦安县中国沙棘种子内生细菌中有4株属于厚壁菌门,1株属于变形菌门。

表2 榆中县和秦安县两种不同生境中国沙棘种子内生细菌纯培养的差异

在属分类水平,榆中县中国沙棘种子内生细菌中,厚壁菌门中2株属于芽孢杆菌属,1株属于葡萄球菌属；变形菌门的1株内生细菌为假单胞菌属。而秦安县中国沙棘种子内生细菌中,厚壁菌门中3株属于芽孢杆菌属,1株属于葡萄球菌属,变形菌门的1株内生细菌为不动杆菌属。可见,芽孢杆菌属和葡萄球菌属细菌在两种不同生境的中国沙棘种子中均有分布,而假单胞菌属只分布于榆中县中国沙棘种子中,不动杆菌属只分布于秦安县中国沙棘种子中。

2.3.2内生细菌高通量测序的差异

(1)内生细菌Alpha多样性指数分析

在Alpha多样性指数中,Chao1和ACE指数表示细菌群落的丰富度,值越大,群落丰富度越高。Shannon和Simpson指数表示细菌群落的多样性程度,Shannon指数值越大,群落多样性越高,而Simpson指数值越小,群落多样性越高。从表3可以看出,榆中县中国沙棘种子内生细菌的多样性和丰富度均高于秦安县。

表3 榆中县和秦安县两种不同生境中国沙棘种子内生细菌的Alpha多样性指数差异

(2)内生细菌Venn图分析

榆中县和秦安县两种不同生境中国沙棘种子内生细菌的Venn图结果如图7所示,从图7可见,榆中县中国沙棘种子内生细菌的OTUs总数为147个,特有OTUs为97个。秦安县中国沙棘种子内生细菌的OTUs总数为75个,特有OTUs为25个,两者共有的OTUs为50个。结果表明榆中县中国沙棘种子内生细菌的种类明显高于秦安县中国沙棘种子内生细菌。

图7 榆中县和秦安县中国沙棘种子内生细菌维恩图

(3)内生细菌群落结构组成分析

高通量测序方法检测到榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子内生细菌的多样性存在明显的差异。榆中县中国沙棘种子中内生细菌包含7门、11纲、31目、44科和68属,秦安县中国沙棘种子内生细菌包含5门、7纲、17目、22科、30属(表4)。

表4 各分类单元内生细菌的群落组成

从门分类水平看,榆中县中国沙棘种子内生细菌主要分布在7个门(表5),秦安县中国沙棘种子内生细菌主要分布在5个门。其中蓝藻门为榆中县中国沙棘种子内生细菌的主要优势门类,相对丰度为95.62%,变形菌门为秦安县中国沙棘种子内生细菌的主要优势门类,相对丰度为91.68%。蓝藻门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门在榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子中均有分布,但相对丰度存在差异。而梭杆菌门和异常球菌-栖热菌门只分布于榆中县中国沙棘种子中,相对丰度均为0.01%。

表5 榆中县和秦安县两种不同生境中国沙棘种子内生细菌在门水平上的差异

在属分类水平,榆中县中国沙棘种子内生细菌分布于68个属,秦安县中国沙棘种子内生细菌分布于30个属,其中榆中县中国沙棘种子特有的属有37个。榆中县中国沙棘种子内生细菌的主要优势属为蓝细菌属,相对丰度为95.09%(表6),秦安县中国沙棘种子内生细菌的主要优势属为寡养单胞菌属,相对丰度为85.60%。其中,在相对丰度前20的属中,榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子共有的属有13个；榆中县中国沙棘种子特有的属有7个,秦安县中国沙棘种子特有的属有7个。

表6 榆中县和秦安县两种不同生境中国沙棘种子内生细菌在属水平上差异

3 讨论

本研究采用纯培养方法和高通量测序方法,分别对榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子内生细菌多样性进行了研究。两种方法均表明,两种不同生境中国沙棘种子内生细菌多样性存在一定的差异。

通过纯培养方法,从榆中县中国沙棘种子中分离得到了4株内生细菌,从秦安县中国沙棘种子中分离得到了5株内生细菌。本实验在进行种子内生菌分离时,只使用了细菌培养的牛肉膏蛋白胨培养基,培养基种类相对单一,这可能是分离到的内生菌种类偏少的主要原因。本研究组前期使用相同培养基,曾对中国沙棘根瘤中的内生细菌进行过分离培养,共得到17株内生细菌[8]。可见,同种植物的不同组织,采用相同的培养方法,可能会分离得到不同种类的内生菌,由于种子是受植物高度保护的封闭性的器官,导致内生细菌种类比其他植物器官要少。而时晓寒等[19]从白皮锦鸡儿种子中分离得到32株内生细菌,与本实验结果有一定差异,这可能是由于植物种类的不同,而导致所分离得到的可培养内生细菌的种类存在差异。在分离内生细菌时,培养条件对内生细菌的种类同样存在一定的影响,不同生境的植物可为微生物提供适宜生存的环境和营养条件,且微生物群体与植物之间能行成复杂的共生关系,而实验室无法完全模拟这种微生物所生存的自然生态环境,这也是所分离得到的内生细菌种类较少的原因之一[20]。因此,在分离沙棘种子内生细菌时,除优化培养条件外,还应尽量模拟沙棘生存的自然生态环境,以获得更多内生细菌资源,最大程度反映沙棘种子内生细菌的多样性。

本研究通过高通量测序结果表明,在门分类水平,蓝藻门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门在榆中县和秦安县两种生境的中国沙棘种子中均有分布,但各门在两地种子中的相对丰度却存在明显差异。有研究表明,蓝藻门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门是植物内生细菌常见的优势门类[21-22],这说明不同生境的同一类植物,甚至是不同种类的植物,其内生细菌的物种组成在门水平上存在一定程度的相似性,但其相对丰度由于植株种类或生境的不同而有所差异,这与张芳芳等[23]的研究结果相一致。本研究中梭杆菌门和异常球菌-栖热菌门只分布于榆中县中国沙棘种子中,这主要由于榆中县马衔山年降水量与年均气温均优于秦安县王铺乡,为内生细菌提供了适宜的生存环境。在属分类水平上,贪噬菌属、甲基杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、拟杆菌属、寡养单胞菌属、叶杆菌属、欧文氏菌属和马赛菌属在榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子中均有分布,但相对丰度存在较大差异；可能是由于两地中国沙棘生长的土壤类型、pH及含水量等因素差异较小,从而导致两地中国沙棘种子内生细菌组成相似。而气单菌属、红树林杆菌属、欧文氏菌属、无杆菌属、柔嫩梭菌属和罕见小球菌属只分布于榆中县中国沙棘种子中；拜叶林克氏菌属、雷尔氏菌属、动球菌属、阿菲波菌属、成团泛菌属、棍状杆菌属、梭菌属只分布于秦安县中国沙棘种子；可能是由于两地海拔、年均降水量以及年均气温存在较大差异,从而导致内生细菌种类存在差异。

本文对榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子内生细菌的多样性研究结果可知,榆中县和秦安县两种不同生境的中国沙棘种子内生细菌均具有丰富的多样性,且二者的多样性存在一定差异,这可能是由于两地海拔相差较大而造成的。有研究表明,由于海拔的差异会导致地区气候特征及周围植被的不同,造成植物种子内生菌的组成存在差异[24]；海拔越高,阳光照射越充足,适应高海拔环境的植物生长状况越好,内生菌多样性越丰富。所以不同海拔的植物,其内分布着不同的优势内生菌,且海拔差异越大,内生菌的物种组成相似度越低[25]。