肉鸡成肌细胞的分离培养与鉴定

2020-09-15陈凯凯王孝成耿照玉姜润深

中国农业大学学报 2020年9期

陈凯凯张成赵菲王驰王孝成耿照玉姜润深

(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)

成肌细胞(Myoblast)来源于中胚层干细胞，是胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞，具有自我更新、促进肌纤维再生以及多向分化等能力。成肌细胞大量增殖后融合为多核肌管，最终分化为成熟的多核肌纤维[1-2]，对骨骼肌发育、修复和再生起着重要作用[3]。成肌细胞作为一种多能干细胞，未退出细胞周期，具有增殖分化潜能大、易于培养等优点，因而受到广泛关注，被作为肌肉发育[4]、肌肉疾病[5]及营养调控[6]等研究的理想体外模型。

成肌细胞的体外分离培养可追溯至1961年，Mauro[7]利用电镜技术首次从青蛙骨骼肌中发现并分离获得骨骼肌卫星细胞，是成体内未激活的成肌细胞。Spencer等[8]利用大鼠成肌细胞研究生长抑素对胰岛素刺激的细胞氨基酸摄取功能的影响；Yang等[9]以猪成肌细胞为试验材料研究Wnt/b-catenin信号通路对肌源性分化的影响。以上研究充分体现了成肌细胞在肌肉发育及营养调控信号通路等研究中的重要作用。目前，包括人[10]在内的多种哺乳动物，如大鼠[8]、小鼠[11]、猪[9]、绵羊[12]以及山羊[13]等均已建立了成熟的原代成肌细胞体外分离培养方法。但禽类生理特征不同于哺乳动物，如成年鸡的体温达到41.5 ℃[14]，远高于哺乳动物，导致肉鸡骨骼肌成肌细胞体外分离培养比较困难，进而限制了家禽肌肉发育及其营养调控机制的相关研究。因此，亟需建立一种肉鸡成肌细胞体外分离培养的方法。本研究拟以肉鸡鸡胚为研究材料，旨在建立一种以肉鸡鸡胚为来源的成肌细胞体外分离培养及鉴定体系，为进一步研究肉鸡肌肉生长发育及其营养调控机制提供研究模型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜淮南麻黄鸡受精蛋，购于安徽某孵化场。

胶原酶Ⅰ型(Sigma)、DMEM高糖培养基(Sigma)、PBS缓冲液(Hyclone)、胎牛血清(Clark)、青霉素-链霉素溶液(100×，Biosharp)、胰蛋白酶溶液(0.25%，Hyclone)、马血清(Hyclone)、细胞培养板/瓶(Costar)、CCK-8试剂(Biosharp)、DMSO(Sigma)、RNAiso Plus(TaKaRa)、cDNA第一链合成试剂盒(ABclonal)、2X SYBR Green 快速qPCR混合液(ABclonal)、一抗Desmin(Servicebio)、一抗MyHC(Santa Cruz)、FITC标记二抗(山羊抗小鼠，Servicebio)和CY3标记二抗(山羊抗兔，Servicebio)等。

1.2 试验方法

1.2.1主要培养基配制

增殖培养基：DMEM高糖培养基中添加20%胎牛血清，1%青-链霉素混合液；

分化培养基：DMEM高糖培养基中添加2%马血清，1%青-链霉素混合液。

1.2.2成肌细胞的分离

取11 d胚蛋，于75%酒精中浸泡杀菌5 min，移入超净工作台自然干燥后取出鸡胚，用含双抗的PBS洗2次后分离胸部肌肉，肌肉组织经PBS洗2次后剪成1 mm3不规则碎片，PBS清洗1次后转移至50 mL离心管中，1 000 r/min离心6 min，弃上清，采用0.1% Ⅰ型胶原酶重悬沉淀，于37 ℃水浴消化，每隔5 min摇匀1次，当消化液中出现一团松散白色絮状物时，加入增殖培养基终止消化，吹打至单细胞悬液，静置1 min后取上清液，200目筛网过滤至新离心管中，1 000 r/min离心6 min，去除上清，收集沉淀，重悬于PBS中，吹打混匀，400目筛网重复上一步骤后，重悬于增殖培养基中。

1.2.3成肌细胞的纯化培养

细胞悬液转移至6孔板(左侧2孔)中，十字摇匀法使细胞分布均匀，标记时间后置于37 ℃、5%CO2培养箱培养30 min，吸取未贴壁细胞至第2排孔，重复3次差速贴壁后进行增殖培养。当细胞密度增殖至70%时，及时进行传代处理，吸弃培养基，PBS洗2次，每孔(六孔板)加入0.25%胰酶0.5 mL，20 s后吸去胰酶，置于CO2培养箱中3 min，随后用增殖培养基终止消化，吹打悬液使未漂浮细胞脱落。为保证成肌细胞纯度，每次传代后进行一次差速贴壁，通过观察30 min贴壁的成纤维细胞数判断成肌细胞纯度。经观察，纯化至第3代，在30 min内无细胞贴壁。因此，后续试验采用第3代成肌细胞。

1.2.4成肌细胞适宜培养温度的确定

取第3代成肌细胞按相同密度接种至两块96孔板中，分别随机选取5孔添加CCK-8试剂10 μL/孔，置于37.0 ℃ 1 h后，于450 nm波长测定吸光度，随后2板分别置于37.0 ℃与39.5 ℃的CO2培养箱中，每天以相同方法测定吸光度，用OD值表示绘制细胞增殖曲线，比较2培养温度下细胞增殖状态，用细胞活力表示细胞增殖状态。

第n天细胞活力=[OD(第n天)-OD(空白)]/ [OD(第0天)-OD(空白)]×100%

1.2.5成肌细胞的成肌诱导分化

当细胞密度增殖至80%时，弃去增殖培养基，PBS洗2次，换成含2%马血清的分化培养基诱导成肌分化，每天换液，观察成肌细胞及肌管生长分化情况。

1.2.6成肌细胞增殖及分化阶段特异性表达基因鉴定

细胞增殖至80%时及诱导分化3 d后，弃去培养基，采用Trizol法提取细胞总RNA，检测合格后采用两步法反转录成cDNA。利用NCBI primer-BLAST设计目标基因的引物，委托通用生物系统(安徽)有限公司合成，引物序列见表1。采用ABI7500定量PCR仪进行RT-qPCR，反应条件如下：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循环40次。

表1 RT-qPCR 引物信息Table 1 Primer information for RT-qPCR

1.2.7成肌细胞Desmin与成肌诱导分化后MyHC免疫荧光鉴定

取纯化至第3代的成肌细胞接种至含细胞爬片的6孔板中，39.5 ℃、5%CO2培养箱培养至适宜密度，取出细胞爬片至平皿中，PBS洗3次；4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗3次，每次5 min(后续PBS洗涤均为3次，5 min/次)；加入1 ml 0.1%Triton X-100，室温孵育15 min，PBS洗涤；加入1% BSA(牛血清白蛋白)溶液，室温封闭1 h；吸去BSA，直接加入一抗Desmin(1% BSA，1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤；加入CY3标记的二抗，避光室温孵育1 h，PBS洗涤；DAPI染核5 min，PBS洗涤；取出细胞爬片，将其倒扣在滴加抗荧光猝灭封片剂的载玻片上，荧光显微镜观察并拍照。取成肌分化诱导5 d后的爬片进行MyHC免疫荧光鉴定，一抗为MyHC，二抗为FITC标记，其他步骤同上。

1.3 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 19.0进行独立样本t检验，结果以平均值±标准误(Mean±SE)表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 成肌细胞的分离纯化及形态特征

使用Ⅰ型胶原酶消化鸡胚胸肌，并经过3次差速贴壁方法去除大部分的成纤维细胞，传至第3代培养30 min后未见成纤维细胞贴壁。因此，经3代纯化，成肌细胞纯度即可满足试验需要。第3代纯化得到的成肌细胞培养24 h后观察，大部分细胞已贴壁，呈现纺锤形或细长梭形(图1(a))，之后细胞迅速增殖，培养至细胞密度达90%左右时，细胞呈螺旋或平行排列(图1(b))。

图1 成肌细胞培养形态Fig.1 Myoblast morphology

2.2 成肌细胞在不同温度培养条件下的增殖曲线

图2 不同培养温度下肉鸡成肌细胞的增殖曲线(n=5)Fig.2 Proliferation curves of broiler myoblasts at different culture temperature (n=5)

由图2可知，肉鸡成肌细胞在37.0 ℃及39.5 ℃均能生长，但39.5 ℃的增殖速率高于37.0 ℃。相同接种密度，39.5 ℃培养条件下，细胞增殖至平台期(部分成肌细胞已分化成肌管)需要4 d，而37.0 ℃需要6～7 d；同时在换液时发现37.0 ℃培养条件下漂浮的死细胞数多于39.5 ℃，因此，后续试验选择 39.5 ℃ 作为肉鸡成肌细胞的培养温度。

2.3 成肌细胞增殖及分化阶段特异性表达基因的相对表达量分析

经RT-qPCR分析，增殖期与分化期均有成肌细胞的特异性标志基因Myf5与MyoD的表达，初步证明该细胞为成肌细胞；与增殖期相比，分化期细胞MyoG与MRF4基因表达量显著升高(P<0.05)(图3)，表明成肌细胞诱导分化效果显著。

2.4 成肌细胞标志蛋白Desmin的表达检测

经免疫荧光分析，Desmin蛋白经CY3标记在绿色荧光激发后呈红色(图4(a))，细胞核经DAPI染色在紫外光激发后呈蓝色(图4(b))，Desmin阳性率在95%以上(图4(c))。此结果充分表明此方法分离纯化的细胞为成肌细胞，且纯度高，可进行后续试验。

2.5 成肌细胞的诱导分化后标志蛋白MyHC的表达检测

当细胞换成含2%马血清的分化培养基诱导成肌分化1 d后，细胞形态较分化前体积增大，界限开始模糊，部分细胞发生融合，细胞方向性排列更加明显；诱导分化3 d后，形成具有多核的肌小管，部分肌管发生无规则搏动；诱导分化5 d后，肌管进一步融合，形成方向性更加明显的长肌管(未在结果中显示)。肌球蛋白重链(MyHC)是肌肉的主要结构和收缩蛋白之一，可作为鉴定成肌细胞分化标志。取诱导分化5 d的细胞进行免疫荧光染色检测MyHC的表达情况，MyHC经FITC标记在蓝色荧光激发后呈绿色，由图5可知，MyHC在细胞质内呈阳性表达。此结果表明此方法分离的成肌细胞有较好的成肌分化潜能，且2%的马血清分化培养基适合肉鸡成肌细胞的分化。

3 讨论

3.1 成肌细胞的分离方法

成肌细胞作为一种多能干细胞，其数量和功能会随着发育的完善逐渐降低。因此，分离时间的选择十分重要[15]。很多学者在分离猪及羊等哺乳动物的成肌细胞时，常选的时期是出生后[11,13]。鸡作为卵生动物，8～12 d的鸡胚已形成了鸡的雏形，能分辨出皮肤、肌肉及软骨等组织，且该时期为成肌细胞快速增殖期，成肌细胞含量较高，鸡胚肌肉发育主要集中在胸部和腿部，但腿部组织结构复杂，血管丰富，分离时容易混入血管上皮细胞、血细胞等杂细胞，而胸部肌肉较腿部更为发达[16]，且组织结构更为单一。综合组织分离难度以及肌肉组织量等多方面因素，本研究选取了11 d鸡胚的胸部肌肉，作为肉鸡成肌细胞的细胞来源。

*表示存在差异性显著(P<0.05)。 * means significant difference (P<0.05).图3 生肌调节因子家族(MRFs)mRNA的表达水平(n=5)Fig.3 mRNA expression levels of muscle regulatory factors (MRFs) (n=5)

成肌细胞的分离方法有多种，目前较为成熟的方法包括组织块法、酶消化法和单根肌纤维法等[17]。酶消化法因其操作简便、细胞分离彻底等优点受到很多学者的青睐。目前，成肌细胞分离方法主要是基于Blau等[18]建立的胰蛋白酶与胶原酶联合分步消化法。胰酶活性强，对浓度及消化时间都有严格要求，容易损伤细胞膜上的功能蛋白[19]，导致细胞生长状态不佳甚至死亡；而胶原酶消化则相对温和，对细胞的损伤较小。因鸡胚发育中期，肌肉排列不紧密，本研究仅采用Ⅰ型胶原酶作为消化酶。此法步骤简单，减少了消化酶对细胞的损伤，且分离的细胞数量以及活力可满足试验需求。

3.2 成肌细胞的纯化方法

目前成肌细胞的纯化分离方法有差速贴壁法、梯度离心法、流式细胞分选法和免疫磁珠分选法等[17]，其中差速贴壁法和梯度离心法较为常用。Hindi等[20]利用差速贴壁法(差速贴壁45 min)纯化从成年小鼠骨骼肌中分离的细胞后成功获得成肌细胞；孙文娟[21]从新生仔猪骨骼肌中分离的慢速贴壁细胞(差速贴壁2 h后)，经成肌诱导后形成多核肌管；王红娜等[12]采用差速贴壁法及梯度离心法纯化绵羊成肌细胞，认为此2种方法纯化程度相当，但梯度离心法更为繁琐。流式细胞分选法、免疫磁珠分选法受设备要求高、试剂价格高等原因的影响，使用不广泛。因此，本研究采用差速贴壁法纯化肉鸡成肌细胞，并在每次传代时均利用该方法去除残余的成纤维细胞，成功获得了纯度95%以上的成肌细胞。

3.3 成肌细胞的增殖培养条件和成肌分化培养条件

肉鸡属于禽类，其生理特征有别于哺乳动物，就体温而言，成年鸡的正常体温为41.5 ℃[14]，远高于哺乳动物。然而，对于禽类细胞的体外培养温度，绝大部分学者选择37.0 ℃，仅有部分学者选择在更接近鸡正常体温的温度条件下培养禽类细胞，如刘晴雪等[22]在39.0 ℃条件下培养了鸡淋巴细胞。初生雏鸡体温较成年鸡低2.0～3.0 ℃[23]，本研究成肌细胞来源于鸡胚，因而选取更接近雏鸡正常体温的39.5 ℃与培养细胞常选择的37.0 ℃进行比较。研究表明，在39.5 ℃的培养温度下，肉鸡成肌细胞增殖速度显著高于37.0 ℃，细胞状态更好。因此，后续试验选择39.5 ℃作为肉鸡成肌细胞的培养温度。大多数细胞在低浓度的血清中可退出细胞周期[24]，2%的马血清可诱导成肌细胞成肌分化[25]。本试验使用2%马血清成功诱导了成肌细胞融合形成多核肌管。

图4 肉鸡成肌细胞Desmin免疫荧光鉴定Fig.4 Immunofluorescence identification of Desmin in broiler myoblasts

图5 肉鸡成肌细胞诱导分化后标志蛋白MyHC免疫荧光鉴定Fig.5 Immunofluorescence identification of MyHC after differentiation of broiler myoblasts

3.4 成肌细胞及其诱导分化

骨骼肌的发育是一个复杂的过程，受许多基因的调控，其中生肌调节因子家族(MRFs)，包括MyoD、Myf5、MyoG及MRF4在其中发挥了重要作用，是肌肉发育的特异性调控因子[26]。研究表明，MyoD和Myf5决定肌源性细胞状态，同时具有开启成肌细胞分化的重要功能，在成肌细胞的增殖期具有较高表达水平[27-28]；MRF4和MyoG在肌细胞的融合与肌纤维的终末分化中起作用。因此，MyoD和Myf5可作为增殖期的标志蛋白，MyoG和MRF4可作为分化期的标志蛋白。本研究发现，增殖期与分化期均有成肌细胞的特异性标志蛋白Myf5与MyoD表达，且与增殖期相比，MyoD基因表达显著下降，初步证明所分离的细胞为成肌细胞，诱导分化3 d后MyoG和MRF4基因表达与增殖期相比显著升高，说明成肌诱导分化方法有效。

结蛋白(Desmin)是一种中间丝蛋白，是肌细胞特有的细胞骨架之一[29]，而成纤维细胞则不表达此蛋白。因此，常用Desmin作为鉴定成肌细胞的标志蛋白。肌球蛋白是骨骼肌中的结构蛋白和收缩蛋白，而肌球蛋白重链(MyHC)是其重要的组成部分[30]。因此，常用MyHC作为鉴定成肌细胞分化的标志蛋白。经免疫荧光鉴定，本研究分离纯化的成肌细胞增殖期Desmin蛋白呈阳性，而分化5 d后MyHC在细胞质内呈显著的阳性表达，进一步证实了本研究分离的肉鸡成肌细胞的纯度高，且诱导分化效果好。