张晓磊 章秋艳 熊 炜 沈 平*

(1.农业农村部 科技发展中心，北京 100122； 2.黑龙江省农业科学院 农产品质量安全研究所，哈尔滨 150086； 3.农业农村部 环境保护科研监测所，天津 300191)

1 转基因植物概述

转基因植物(transgenic plant)是指将带有目标性状的基因通过基因工程技术的改良，然后导入到受体植物基因组中的植物。这些外源转入的目的基因不仅能够在后代中稳定遗传，同时还可以使转基因植物产生新的农艺性状，如抗虫、耐除草剂、抗逆、抗病、改善作物营养和品质等[1]。转基因作物自1996年商业化以来，种植面积从最初的170万hm2增加到2018年的1.917亿hm2，增长了112倍。目前全球共有70个国家/地区的转基因安全监管机构允许转基因作物用于粮食、饲料以及商业化种植。此外，已经上市的转基因作物除了大豆、玉米、棉花和油菜以外，还有其他转基因作物如苜蓿、甜菜、木瓜、南瓜、茄子等，因此给全球消费者呈现了越来越多的选择。具有防止褐变、丙烯酰胺含量低等性状的马铃薯以及防褐变的Arctic苹果已经开始在美国和加拿大进行种植。此外，巴西还批准了一种抗虫甘蔗，并于2018年进行商业化种植[2]。全球转基因作物的种植和进口量持续激增，进一步证明了转基因作物带来了一系列的农业、经济和环境效益。随着生物技术的不断发展，复合性的转基因植物不断增加，因此对其安全监管和精准检测也有了更高的要求。因此，转基因检测技术的开发和不断创新显得格外重要，也能够为国家对转基因产品的安全监管提供更有力的技术保障。

2 转基因植物安全评估

转基因植物从实验室研发到进行安全评估，再到商业化是一个比较漫长、投入较大，同时技术要求比较高的过程。“实质等同性”原则是目前国际上公认的转基因生物安全评价的可行性原则，指的是转基因生物与自然存在的传统生物在相同条件下进行可行性比较，如果实质相同，就应该同样对待，即认为该转基因生物安全[3]。我国在国际上的转基因监管经验的基础之上，建立了适应我国国情的农业转基因生物技术安全监管的法律法规体系、技术支撑体系和政府行政管理体系。在建立的转基因生物安全评价监管体系中主要分为5个阶段，分别是实验研究、中间试验、环境释放、生产性试验和申请安全证书，而且我国要求对转基因产品实施强制标识制度。在安全评价过程中，主要是对转基因植物分子特征方面进行分析和鉴定，分子特征的识别主要是从核酸水平和蛋白质水平评估外源基因插入片段的整合和表达情况及其在代际间遗传稳定性，明确外源基因的插入位点、插入的具体碱基序列、表达的产物及发挥的特性、稳定性等[4]。在确定转基因植物分子特征的基础上，建立有效的转基因身份确认方法，从而用于转基因作物的日常安全监管和消费者知情权告知等[3]。转基因植物的分子特征分析过程具体见图1。

图1 转基因植物安全评估的分子特征分析Fig.1 Molecular characteristics analysis of the safety assessment of transgenic plants

3 转基因植物及其产品检测方法

随着转基因技术的不断发展，转基因检测技术的研究和开发成为全球转基因安全监管和安全评价的重要组成部分。目前转基因植物检测和安全管理工作主要体现在3个方面：一是出入境检验检疫，即进出口转基因产品的货证相符检验检疫；二是法律监管，即对转基因植物及其产品进行市场监管与行政执法同时监督检验；三是身份验证，即对转基因植物及其产品安全评价指定对象的身份确认及分子特征信息鉴定[5]。

转基因植物及其产品的检测，主要包括转基因植物的产品成分检测、环境安全检测、食用安全检测3个方面。

3.1 转基因植物及其产品成分检测

转基因植物的产品成分检测主要是针对其转入的外源基因的特异性DNA序列及其表达的蛋白质展开的。因此，转基因植物及其产品的检测方法主要是基于核酸水平和基于蛋白质水平的检测。

3.1.1基于PCR技术的检测方法

核酸分子，尤其是DNA分子稳定性强，加工过程中不易降解，因此基于DNA水平的检测方法已成为转基因植物检测的主流手段[6]。PCR方法是目前最准确的应用于转基因植物检测的方法，可用于单重、多重筛选检测或转基因品系鉴定，也是目前大多数转基因高通量检测中靶标扩增方法之一。基于PCR的检测方法主要包括定性PCR和定量PCR，定量PCR又包括最常用的定量PCR (quantification PCR)和数字PCR (digital PCR)。定量PCR是在PCR扩增中实时收集荧光信号，通过荧光信号-Ct值-靶基因的起始浓度三者之间的关系，从而确定靶基因的拷贝数或转基因含量[7]。数字PCR是近些年发展起来的一种比较精确的核酸绝对定量方法，该方法是将微量样品进行极度稀释和分液，直到每个细分的待测样品中所含有的待测分子数不超过1个后, 再将所有细分的待测样品进行PCR扩增，然后对扩增反应的样品逐一计数，从而判断待测样品的最初浓度[8]。数字PCR的优势在于不需要依赖Ct值和标准曲线，就能够实现对起始样品的绝对定量。目前，主流的数字PCR平台有3种：第一种是基于集成流体通路(IFC)芯片技术的数字PCR (chamber digital PCR)；第二种是微滴式数字PCR(droplet digital PCR)；第三种是基于微流体芯片和通道的数字PCR平台-OpenArray系统。不同的数字PCR平台均已经应用于转基因生物及其产品的检测，并且在转基因标准物质的量值测定方法中得到了很好的应用[9-10]。

转基因植物及产品根据检测靶标的不同，主要包括筛选元件序列(如CaMV35S启动子、NOS终止子)、靶标特异性序列(如Cry1Ab、CP4-EPSPS)、构建特异性区域序列(如NOS终止子和NPTII基因之间连接的序列)、品系特异性序列(基因组和外源插入基因整合位点的重组序列)。近年来，已有大量研究报道了定性PCR、定量PCR以及数字PCR技术在不同转基因植物品种、转基因成分检测上的应用，具体信息见表1[11]。

表1 已报道或验证转基因生物检测方法Table 1 Reported or validated test methods for genetically modified organisms

3.1.2等温核酸扩增技术

等温扩增技术是近些年快速发展起来的快速核酸检测技术，因其扩增过程不需要特殊仪器和温度循环就能快速、高效地实现扩增，并且还有成本低、特异性强、灵敏度高等优点。核酸等温扩增技术有很多种，如环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequenced-based amplification, NASBA)、滚环扩增检测技术(rolling circle amplification, RCA)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)等[28-29]。

在转基因检测领域中，环介导等温扩增技术(LAMP) 已经得到较多的应用[30]。该方法通过设计的引物能特异性地识别靶标序列6个区域，在链置换性聚合酶(Bst酶)作用下，在恒温(60～65 ℃)条件下大约40～60 min即可完成核酸扩增[31]。在转基因植物检测领域中， LAMP在转基因筛选元件(如P-CaMV35S、T-NOS、P-NOS、P-FMV35S)、特异性基因(如cry1Ab、cry2Ab、cry3A、Phytasegene)、转基因事件特异性(TT51-1、Bt176、BT11、MON863、MON89788、MS8)等方面都有所应用[32-37]。Wang等[38]建立了7种常见转基因元件(CaMV35S启动子,FMV35S启动子,NOS终止子,bar,cry1Ac,CP4epsps,pat和nptII)的LAMP检测方法，并进行了国内外协同验证，为建立该方法的国家标准建立了良好的基础[39]。Chen等[36]用LAMP方法实现了转基因产品可视化检测。Kiddle等[40]报道了一种提高LAMP检测灵敏度的方法，将一种荧光报告基团BART与LAMP方法结合，使其在转基因含量检测中灵敏度可达到0.1%。

核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequenced-based amplification, NASBA)也是一种在PCR基础上发展起来的新扩增技术。该反应主要依赖3种酶，即AMW逆转录酶(起到DNA聚合酶的作用)、T7 RNA聚合酶和RNA酶H。除此之外，该方法的关键在于引物的设计，其中一条引物的5′端含有T7 RNA多聚酶的启动子，3′末端与靶序列互补，这一引物是用于合成cDNA的。另一条引物的碱基序列与cDNA的5′末端互补。这种方法最初主要用来进行RNA扩增，但同样也适用于DNA扩增[41]。Dobnik等[42]建立了一种基于NASBA多重扩增方法对转基因事件MON810和MON863进行定量分析和复合检测，同时能够跟芯片杂交技术结合进行转基因检测。于常海等[43-44]发明了用NASBA方法检测转基因大豆A2704-12和MON89788的专利。

滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是一种效仿自然界中病原微生物环状DNA分子滚环复制方式而建立的检测方法[45]。RCA在扩增时由单链DNA引物在DNA聚合酶的作用下，沿着环状DNA模板由5′端向3′端方向合成一段线状单链DNA产物。徐君怡等[46]发明的专利，首次探索了锁式探针RCA技术与实时荧光PCR技术相结合，即实时荧光RCA法，是可以同步检测10种转基因玉米品系的高通量、高特异性、高灵敏的检测技术。郝振明等[47]开发了一种结合超分枝滚环扩增技术的试纸检测法，能够实现对食品中的转基因成分进行初步的定性检测。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)，主要是是利用重组酶和单链结合蛋白在常温下共同作用，从而实现引物与模板的特异结合，该方法最大的特点是不需要核酸解链和退火的过程，只需一对引物，在37 ℃恒温条件下进行模板核酸的扩增[48]。目前，邓婷婷等[49]建立了基于RPA技术，建立了转基因水稻Cry1Ab/c基因的快速检测方法，特异性较好，尤其适用在基层实验室及现场快速检测转Cry1Ab/c基因水稻及其制品。金芜军等[50-51]发明了转基因抗虫水稻华恢一号(TT51-1)、科丰6号品系特异性的RPA检测方法。徐潮等[52]建立了基于RPA技术对玉米、水稻、棉花和大豆等作物中的转基因成分进行了检测。RPA 技术的优势在于不需要依赖复杂的仪器设备，因此即使在经济条件不好，资源匮乏的区域也能够具有很好的应用前景，更为以后的现场田间检测提供了更多的选择。

3.1.3基于蛋白水平的检测方法

蛋白质水平的检测是根据免疫学的原理，即利用转基因产品中表达的特定蛋白作为抗原和抗体特异性结合的原理对转基因产品进行快速检测。目前, 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和侧向流动免疫测定(lateral flow devices, LFD)是2种最主要的基于蛋白水平的转基因产品检测方法[53]。

目前已经有很多基于不同蛋白的ELISA及LFD检测方法应用在不同的转基因作物中，具体见表2。

表2 转基因植物基于蛋白水平的检测方法Table 2 Detection method of transgenic plants based on protein level

3.1.4基于二代测序的转基因植物检测技术

随着转基因生物越来越多地出现在人们生活中，快速、高通量、灵敏、自动化的转基因检测方法成为了重要的发展趋势，也成为了转基因生物及其产品检测的重点方向。目前已有的转基因检测方法主要是基于免疫学原理及PCR技术，而且这样的转基因检测方法需要提前知道部分转基因生物转入的外源基因的序列信息，否则无法对其进行检测。然而对于某些只知其部分序列或者完全不知道其序列的转基因植物来说，对这样的转基因生物进行监管及检测仍然存在很大的挑战。二代测序技术(next generation sequencing, NGS)是近些年来提出的一种新技术，它可以大规模地对DNA片段进行测序，从而实现数百次的测序读数，因此在转基因植物检测领域有着很好的应用前景[62]。相比于传统的Sanger测序技术，NGS在测序速度、测序通量及测序规模上占据了绝对的优势。目前将二代测序技术(NGS)应用在转基因植物检测领域，主要存在2种策略:一种是已知部分序列信息，将其进行富集后进行测序分析，也称为靶标富集法；另一种是完全不知样品信息，需要对其进行全基因组重测序来进行分析，称为全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)方法[63]。随着近些年NGS的快速发展，该项技术已经运用在了不同的领域中，转基因植物检测及鉴别也包括在其中，具体见表3。

靶标富集策略可以从复杂基因组中获得需要的目的基因序列，这点对基因组比较复杂的植物来说更有意义。因为即使只有部分已知序列，想要捕获更多目标区域的序列，二代测序技术不管在时间还是成本上，都有绝对的优势和能力。对于靶标富集策略主要有2种方法：一种是利用PCR扩增的产物建立DNA文库；另一种是从整个基因组文库中选择特定DNA片段进行测序。Liang等[64]通过富集靶标基因vip3Aa20，并用2种不同的二代测序平台(Illumina或Pacific Biosciences平台)对富集产物进行测序，研究表明2种不同测序平台都能够对产物进行分析。与Illumina技术相比，Pacific Biosciences系统并不总是对基因组DNA进行剪切，因此在许多情况下可以避免从头组装。而且，对于不同大小片段的DNA，包括长达40 kbp片段都有一定的优势。2014年，Song等[65]从不同浓度的玉米及大豆样本中通过PCR扩增子测序鉴定出了是否是玉米或是大豆，不仅鉴定出了不同的转基因Bt11、Bt176，同时也鉴定出了不同的转基因元件如CP4-EPSPS、p35S启动子和tNOS终止子。

全基因组重测序(whole genome sequencing, WGS)策略能够在对样本信息完全未知的情况下对转基因成分进行分析。这种测序策略是将基因组DNA剪切成小片段，构成DNA文库，然后连上接头进行测序。将生成的reads通过生物信息工具与已知的转基因生物信息进行比对。当对外源插入序列未知时，插入片段及旁侧序列是通过能够比对上或未比对上植物内源参考基因组的contig来鉴别的。WGS方法已经应用在了转基因水稻LLRICE62事件的分子特征分析中，其以粳稻基因组(Oryzasativassp.Japonica)作为水稻参考基因组进行比对，与研发者提供的信息相一致并找到了未知的插入位点[66]。此外，WGS也同样应用在转基因亚麻FP967及转基因水稻TT51-1和T1c-19的分子特征分析中[4,67]。因此，在转基因检测领域，尤其是对未经过认证的转基因生物及未知转基因生物，二代测序(NGS)技术发挥了极大的优势，可以通过鉴定其序列，直接证明转基因生物在食物/饲料基质中的存在。然而在日常的转基因检测中实施NGS仍然是困难的，因为其成本相对较高，并且需要足够的计算机基础设施和专业的生物信息人员来处理数据。尽管如此，二代测序技术依然能够在转基因检测领域中具有广阔的应用前景，更为样本成分复杂、样本信息未知的转基因检测提供了一种可能，更为转基因生物的安全评价提供了有力的技术支持和保障。

表3 现有的二代测序技术在转基因植物检测上的应用Table 3 Application of current second-generation sequencing technology in detection of transgenic plants

3.2 转基因植物的环境安全检测

转基因植物会影响其周围的生存环境，主要表现在：1)对其生长土壤的影响，比如促进或妨碍土壤中一些微生物的生长与繁殖，改变土壤中的营养成分等；2)对周围环境中生物多样性的影响，比如实现自主性授粉的部分转基因植物会导致该地区蝴蝶、蜜蜂等昆虫数量的减少；3)对周围植物生存竞争能力的影响，比如由于环境的选择性，会导致最适应植物的大量繁殖等[69]。因此，需要对转基因植物的环境安全进行检测及评估。

目前转基因作物中，抗虫、耐除草剂的性状应用最多。含有耐除草剂性状的转基因植物的使用大大减少了草甘膦、草铵膦除草剂的使用，抗虫转基因作物的应用也减少了化学杀虫剂的使用。因此，对于目前转基因植物的环境安全检测，最主要从以下这些方面进行检测及评估：1)靶标除草剂耐受性检测；2)非靶标除草剂耐受性检测；3)抗虫性检测；4)生存竞争能力检测；5)花粉活力检测；6)对生物多样性的影响检测；7)对非靶标生物(如二斑叶螨、家蚕、蚯蚓、蜜蜂等生物)影响检测。

3.3 转基因植物的食用安全检测

转基因植物的食用安全性一直是政府、群众关心的焦点话题。随着转基因技术的发展，影响转基因食品安全性的主要因素主要包括2类，即转入的基因及外源基因表达的蛋白，这2个因素也是评价转基因食品安全性的主要对象。转基因植物的食用安全检测主要考虑几下一些因素：1)该蛋白是不是长期安全食用的；2)该蛋白的结构与功能是否与长期安全食用的蛋白有联系；3)该蛋白在生物功能上的安全性；4)在氨基酸序列上评估该蛋白是否与已知过敏原、抗营养因子及毒蛋白等具有同源性；5)评估该蛋白在理化特性上是否与过敏蛋白相同；6)该蛋白是否容易被胃、肠道蛋白消化；7)转基因食品的非预期效应[70]。此外，对于转基因安全性检测及评价存在的诸多不确定性，为了尽可能最大程度保证转基因植物的经济与社会效益，各国政府组织、科研人员和国际组织秉承着依据科学、实质等同性、个案评估、逐步评估等原则制定出较完善的评价体系[71]。

基于影响转基因植物食用安全检测的因素及评估转基因植物安全性的原则，根据CAC《重组DNA植物及其食品安全性评价指南》(CAC/GL 45-2003)的规定，目前对转基因植物的食用安全性评价主要从如下这些方面进行评估：1)营养成分；2)抗营养因子；3)毒性；4)过敏性；5)抗生素抗性等。在转基因产品的食用安全性评价中，对其营养价值的评估是很重要的部分，其次对其关键成分，要利用动物喂养试验评估转基因与非转基因食品的安全性[71]。

我国对转基因植物的食用安全性检测，以实质等同性原则为基础，结合个案分析、逐步评估和预先防范的原则等制定，主要包括4个部分：1)评估转基因植物及其产品的基本信息，包括受体与供体的食用安全情况、实际外源插入信息及目的基因及载体构建图谱等；2)营养学评估，包括关键营养成分、抗营养因子等；3)毒理学评估，包括急性毒理实验、亚慢性及慢性毒性测试等；4)依据FAO/WHO的过敏原评估标准进行过敏性评估；5)其他包括抗生素标记基因安全性、非预期效应及其在加工过程中的安全性等。

4 转基因植物检测技术的标准化

4.1 转基因植物检测技术标准化的必要性

转基因植物的安全问题一直以来是全球关注和争论的焦点。大多数国家及国际组织一直都高度重视转基因的安全性问题，不仅制定了相关法律法规，实施转基因生物标识制度，同时不断加强检测技术研究及其标准化，并出台一系列检测技术标准和规范[72]。在标准化组织机构的组织下，通过标准化程序及标准化体系制定的转基因植物检测技术标准可以为转基因产品的监管及转基因管理政策的实施提供强有力的技术支持和依据。

4.2 国外转基因植物检测技术标准化的现状

目前，世界各国及国际组织也相继建立了专门的机构或部门负责转基因检测技术标准工作的制定，我们所熟知的部门主要有联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)、国际食品法典委员会(CAC)、国际标准化委员会(ISO)、欧洲标准化委员会(CEN)等。不同国家为转基因检测技术标准制定成立专门的工作小组，主要负责检测技术研究、检测方法验证、检测技术标准制定及审核发布等(https:∥www.antpedia.com/standard/sp/633873.html)。例如，欧洲标准化委员会食品分析技术委员会(CEN/TC275)成立负责转基因食品检测标准制定的工作小组。在标准化体系建设中，欧盟针对转基因植物检测，从样品抽取、核酸提取、核酸检测、蛋白检测等方面开展了一系列的研究，制定了相对比较完善的检测方法及技术体系，并对已建立的检测方法开展系列验证。目前，国际标准化委员会(ISO)已经发布过7个标准，欧盟也有相应的标准，比如欧洲标准化委员会(CEN)关于转基因检测方法发布了4项标准，其中德国标准化学会、法国标准化协会、英国标准学会关于转基因检测和核酸检测发布的标准均与ISO与CE检测标准一致，具体信息可见表4。

4.3 我国转基因植物及其产品检测技术标准化体系的现状

我国政府也十分重视转基因生物安全管理工作，建立了《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物安全评价管理办法》等配套管理办法，组织制定了转基因生物安全检测标准体系框架和标准修制订规划[73]。我国从事转基因检测机构主要分布在国家质检系统和农业系统，质检系统主要负责进出口的转基因检测工作。国内转基因生物标准主要是由农业部和质检总局制定和发布，全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会秘书处设在农业部科技发展中心。质检总局发布的标准形式为国标(GB)及其行业标准(SN)，农业部发布的标准形式有农业行业标准(NY)和农业部公告两种。

表4 国际组织/机构发布的转基因检测技术标准Table 4 Technical standards for genetic modification testing issued by international organizations/institutions

目前我国已制定了关于转基因生物检测方法的农业标准、行业标准和国家标准有128项，其中农业标准有89项，行业标准有26项和国家标准有13项。这些标准主要分为3类，分别为环境安全评价标准、食用安全评价标准和产品成分检测标准(https:∥www.antpedia.com/standard/sp/633873.html)。标准中覆盖了大部分已经商业化的转基因大豆、水稻、玉米、油菜、棉花、小麦、苜蓿、甜菜、番茄等含有的抗病毒、抗虫及耐除草剂基因、报告基因、内标准基因等检测项目，但不足的是，转基因花卉、水果和转基因林木等仍然缺乏相关的检测技术标准，还有待后续不断研究和开发[74]。

与发达国家相比，我国转基因生物安全管理、转基因检测技术和标准化研究还存在一定的问题和不足，仍有提升的空间[75]。目前我国转基因植物检测标准常见的问题有：标准中部分引物特异性不高、定性检测方法中部分扩增片段太短、未根据基因组复杂性规定DNA用量、标准制定滞后于转基因植物培育、未商业化转基因植物缺乏相关检测标准、定量标准未覆盖大部分商业化的转基因植物等。对于上述提出的不足，对于转基因植物检测技术标准化的工作来说，还需进一步的探讨和完善[76]。

为了促进我国转基因植物及产品检测技术标准化进程，首先需要在转基因植物安全性和检测技术研究上投入更多的人力和财力；其次整合优势资源，构建我国转基因生物检测技术网络平台，形成与国际接轨的转基因植物检测技术研究及其标准化体系；此外，随着新的转基因植物品种的出现，努力使标准完全覆盖商业化转基因品种。

5 总结与展望

随着转基因植物新品种的不断研发和培育以及新的基因编辑技术和产品的出现，使得转基因植物及产品的生物标识管理和检测变得日益重要，因此需要科研人员开发更多、更有效的新技术、新方法用于转基因检测。快速、高通量的检测方法在未来将成为转基因植物及其产品检测技术研发的主要方向，为我国甚至世界各国的转基因生物标识和监管提供强有力的工具。此外，我国仍需完善转基因植物的安全监管检测体系，进一步加快检测技术标准化研究进程。从长远角度考虑，转基因植物检测技术研发必须与其标准化及安全管理协调进行，从而保证转基因植物及其产品在我国长期有效的安全监管。有效的技术标准及安全监管可以保障技术研究快速发展，研究技术的发展有助于促进转基因植物安全监管能力的提高，两者协同进行，能够更好地为我国转基因检测技术及其标准化研究工作提供有力的技术支持和保障。