杨林毅 陈潞 陈泽历

摘要：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是多年生草本植物，其药用部位为地下根茎，是一种重要的中药材。为明确侵染滇重楼的病毒病原，对采自云南省曲靖市的滇重楼进行透射电镜观察、DAS-ELISA和RT-PCR技术检测。在透射电镜下观察到杆状病毒粒子，大小为（200～300） nm×（20～36） nm。对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测，结果表明，其中5份病样呈阳性。通过RT-PCR技术扩增、克隆获得1个全长为6 357 bp的曲靖分离物PMMoV-QJ的全基因组序列。将PMMoV-QJ的全基因组序列与国内外已经报道的10个PMMoV分离物进行同源性分析比对，其同源性为99.42%～99.81%。基于全基因序列的系统发育分析表明，PMMoV-QJ与韩国分离物亲缘关系密切。本研究明确了该分离物的亲缘关系，从分子水平鉴定该分离物，为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。

关键词：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）;辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）;鉴定;序列分析

Abstract： Paris polyphylla var. yunnanensis is a perennial herb， and its medicinal part is underground rhizomes. It is an important chinese medicinal material. In order to clarify the viral pathogens infecting the Paris polyphylla， the transmission electron microscopy， DAS-ELISA and RT-PCR techniques were performed on the Paris polyphylla collected from Qujing， Yunnan province. Baculovirus particles were observed under transmission electron microscopy and were（200～300）nm ×（20～36）nm in size. The results of DAS-ELISA on 7 samples collected showed that 5 of them were positive. A whole genome sequence of a 6 357 bp Qujing isolate （PMMoV-QJ， accession number MK784568） was cloned by RT-PCR amplification. The homologous sequence of PMMoV-QJ were analyzed by homology with 10 PMMoV isolates reported at home and abroad， and the homology was between 99.42% and 99.81%. Phylogenetic analysis based on the whole gene sequence showed that PMMoV-QJ was closely related to Korean isolates. This study clarifies the genetic relationship of the isolate， and identifies the isolate from the molecular level， which provides a theoretical basis for the prevention of the subsequent viral disease.

Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis; pepper mild mottle virus（PMMoV）; identification; sequence analysis

滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）又称独角莲，属延龄草科重楼属（Paris）多年生草本植物，其药用部位为地下根状茎，分布于亚欧大陆温带和热带地区，在中国主要集中在西南地区，其中以云南省滇中、滇东和滇东北、滇西和滇西北为主[1]。滇重楼宜阴畏晒，喜湿忌燥，通常生长在气候湿润、雨量适当、海拔1 300～3 000 m的蔽阴处。作为一种珍稀中草药，滇重楼以根茎入药，其主要化学成分为甾体皂苷，并含多糖、黄酮苷、β-脱皮激素及氨基酸，具有较强生物活性，有抗微生物、镇痛镇静、消肿止血、清热解毒、凉肝定惊等功效，是云南白药、楼莲胶囊、宫血宁胶囊等云南品牌中成药的主要原料植物之一[2]。由于长期对野生滇重楼掠夺式的采挖，加之滇重楼自然繁殖率低，生长缓慢且周期长，野生滇重楼出现严重紧缺现象，现在已成为云南省30种稀缺濒危天然药物之一。野生滇重楼很少发生病虫害，然而随着滇重楼规模化人工种植的发展及栽培年限的增加，新的病害不断出现，加之滇重楼种植于灌溉方便、地势平坦且排水良好的酸性土壤中，土壤肥沃疏松、有机质和腐殖质含量较高，为种植滇重楼提供了良好条件，但同时也加剧了病害的发生。这些病害的发生对滇重楼的产量和品质造成不同程度的影响，轻者减产、重者绝收，使农户遭受损失。目前报道的滇重楼病害多为真菌性病害，包括根腐病、茎腐病、叶斑病、叶枯病、猝倒病等和细菌性病害，细菌性病害主要是细菌性穿孔病[3]，关于病毒病害报道较少。

辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）属于烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的正义链RNA病毒，基因组RNA由6 356或6 357个碱基组成，编码病毒复制酶蛋白P126和P183、运动蛋白（MP）和外壳蛋白（17kDa）等至少4种蛋白，是世界范围内造成辣椒经济损失的重要病原之一[4，5]。PMMoV可以通过种子和汁液摩擦传播，带毒种子、发病植株和病土是重要的侵染来源。在自然条件下，病毒可感染所有辣椒品种，包括甜椒品种和辣椒，还可以通过机械接种感染茄科、藜科和苋科的部分宿主。PMMoV最早报道于美国辣椒[6]，1994年在中国新疆辣椒上被首次发现[7]。感病辣椒叶片呈现斑驳、花叶、扭曲或皱缩症状，茎秆上出现褐色坏死斑，果实变小畸形、果面斑驳或出现凹陷坏死等明显病毒病症状，后期辣椒果实外观和内在品质均显著变差。到目前为止还没有关于该病毒感染滇重楼的报道。近年来，发现云南曲靖地区出现了病毒性病害。本研究采用反转录（RT-PCR）和双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）等技术对云南省曲靖地区滇重楼的病毒病进行克隆和序列分析，明确该分离物的亲缘关系，从分子水平鉴定该分离物，为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要试剂

本研究在云南省曲靖市进行采样调查，采集病样具有花叶、斑驳和退绿症状。病样于-80℃保存。

供试PMMoV的DAS-ELISA的检测试剂盒购自Creative Diagnostics公司，植物总RNA提取试剂盒（OMEGA.Plant RNA Kit）购自昆明硕阳科技公司，Prime ScriptTM Ⅱ Ist Strand cDNA Synthesis Kit合成试剂盒购自TaKaRa生物工程（大连）有限公司，Power Taq PCR Master Mix试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 电镜观察

取退绿症状明显的滇重楼病叶进行病毒粒子提纯，病毒粒子提纯参照Zhao等[8]描述的方法，提纯的病毒粒子用浸出法在电子显微镜下观察。用铺有Formver膜的电镜铜网沾取病毒粗提纯液，用吸水纸吸干，加1滴2%磷钨酸（pH 7.0）负染1 min然后吸干，待干燥后用JEM-1200EXII透射电镜观察，并用GATAN CCD相机拍照。

1.3 血清学检测

取田间采集到的滇重楼疑似感染病毒病叶，加入PBS缓冲液进行研磨裂解后，采用DAS-ELISA法进行检测。检测方法按Pepper mild mottle virus （PMMoV） ELISA Kit（DEIAPV220）试剂盒说明书进行（Creative Diagnostics），以健康滇重楼叶片为阴性对照，以缓冲液为空白对照。

1.4 滇重楼叶片总RNA提取及反转录

取2份症状较明显的滇重楼病叶，以1份健康的滇重楼叶片为对照提取总RNA。具体方法按照OMEGA.Plant RNA kit试剂盒说明书进行，将提取得到的总RNA于-80 ℃保存备用。提取得到的总RNA作为模板用于cDNA第一链合成，总反应体系20 mL：Total RNA 4 mL，下游引物2.5 mL，dNTP Mixture（10 mmol/L each）1 mL，ddH2O 2.5 mL，混匀，65 ℃温度育5 min，置于冰上急冷，加入5?Prmine ScriptⅡ Buffer 4 mL，Prime ScriptⅡTase 1 mL，RNase Inhibitor（40 U/mL） 0.5 mL，RNase Free dH2O 4.5 mL，42 ℃退火90 min，72 ℃终止反应15 min，在4 ℃保存条件下进行逆转录反应，所得cDNA产物用于PCR扩增，采用2×Power Taq PCR Master Mix试剂盒，反应体系参照厂家说明书，扩增体系50 mL，扩增反应体系为2?Power Taq PCR Master Mix 25 mL，上游引物（TobUni1）5 mL，下游引物 （TobUni2） 5 mL，cDNA模板 2 mL。反应条件为94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸3 min，35个循环扩增，72 ℃终止延伸8 min，最后凝胶电泳检测。

1.5 基因组克隆及分析

根据GenBank中PMMoV中国分离物PMMoV-CN（登录号AY859497）的基因序列设计3对特异性引物[9]（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

将PCR产物分别进行电泳并切胶回收后直接克隆于载体pGEM-T Easyvector （Promega），总反应体系：2×Rapid Ligation Buffer 5 μL，PGEM-T Easy Vector 1 μL，切胶回收产物3 μL，T4 DNA Ligase     1 μL。将配制好的连接体系轻轻混匀，在室温静置1 h或者4 ℃条件下静置过夜用于转化DH5α。转化大肠杆菌感受态细胞DH5α在含50 ng/μL氨苄青霉素的平板上培养过夜，经蓝白斑筛选挑取蓝斑（对照）白斑进行培养，提取质粒。将筛选出的含重组质粒的阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。采用DNAMAN软件及BLAST（http：//www.NCBI.nlm.nih.gov/）进行序列分析，采用MEGA7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 滇重楼病毒样品田间症状

调查发现，发病滇重楼叶片呈现退绿、花叶、黄化或皱缩等明显的病毒病症状（图1）。

2.2 电镜观察病毒粒子形态

取呈现退绿症状明显的滇重楼病叶进行病毒粒子提纯，提纯的病毒粒子在透射电镜下观察到杆状病毒粒子，大小为（200～300） nm×（20～36） nm（图2）。

2.3 DAS-ELISA血清学检测

对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测，结果表明，其中5份病样呈阳性（表2）。

2.4 PMMoV-QJ RT-PCR扩增结果

采用PMMoV特异性引物分别为PMMoV1F、PMMoV1R、PMMoV2F、PMMoV2R、 PMMoV3F和PMMoV3R。以反转录的cDNA为模板进行扩增，得到3段单一的PCR产物。

2.5 PMMoV-QJ的全基因组测序

对3段单一的扩增产物进行测序，通过DNAMAN软件拼接获得PMMoV-QJ（登录号MK784568）的基因组序列全长为6 357 bp。PMMoV-QJ的全基因组序列包含1 880个碱基A、      1 526个碱基G、1 779个碱基T和1 172个碱基C，这4种碱基在PMMoV-QJ的全基因组序列中所占的百分比依次为29.57%、24.01%、27.98%和18.44%。5′-非编码区（5′-UTR）和3′-非编码区（3′-UTR）分别含有69和199个碱基。PMMoV-QJ有4个开放阅读框架，编码4个蛋白，分别为126 kDa蛋白（70-3 423 nt）、183 kDa蛋白（70-4 908 nt）、28 kDa蛋白（4 909-5 682 nt）和17 kDa蛋白   （5 685-6 158 nt）。第一個开放阅读框编码的蛋白与病毒复制相关，同时第一个开放阅读框与第二个开放阅读框共同编码一个与病毒复制相关的蛋白，第三个开放阅读框编码的蛋白与病毒移动有关，第四个开放阅读框编码的蛋白为病毒衣壳蛋白。