李心语 安清明 王大会

摘要：畜禽基因与其性状的关联研究较为广泛，具有编码效应的DNA和RNA对性状有重要影响，非编码RNA中的miRNA可以通过影响mRNA的翻译而对畜禽的性状产生特定影响。总结了miRNA在畜禽脂肪代谢中的研究进展，以期为今后进一步研究畜禽脂肪组织中miRNA的表达和功能提供参考。

关键词：miRNA;脂肪沉积;畜禽;育种

Abstract： The association between genes and characters of livestock and poultry was widely studied. DNA and RNA with coding effect have important effects on traits. In addition， miRNA in non-coding RNA can have a specific effect on livestock and poultry traits by affecting the translation of mRNA. The research of miRNA in fat metabolism of livestock and poultry was summarized， in order to provide reference for further research on the description and functions of miRNA in fat tissue of livestock and poultry.

Key words： miRNA; fat deposition; livestock and poultry; breeding

在动物的生长过程中，除了肌肉的增长，还有脂肪的沉积，脂肪沉积是动物体脂肪合成与分解两个过程协调作用的复杂生化过程，受多种因素影响。在动物成年后，皮下、肌肉和内脏都易沉积更多脂肪，而大量脂肪的沉积可能会对动物的某些性状及生理过程产生不利影响。评价畜禽肉品质的重要指标之一为胴体皮下和肌内脂肪的含量。由于皮下脂肪较胴体肌内脂肪更易沉积，其结果往往会导致肌内脂肪储备相对缺乏而皮下脂肪过多，这被认为是畜禽高品质肉质生产的主要障碍之一。近年来，科研工作者运用高通量测序技术不断研究畜禽脂肪组织中含有的miRNA，并对其作用和影响进行探索，证实了miRNA在畜禽的脂肪沉积与代谢、脂肪细胞的分化、脂肪细胞的增殖等生理过程中都起关键作用。

1 miRNA简介

microRNAs（miRNAs）是由长度为20～25个核苷酸组成的一类内源性且具有一定调控作用的非编码小RNA，成熟的miRNAs是将初级miRNAs转录物通过特定核酸酶的剪切加工而形成的，其随后会组装进RNA诱导的沉默复合体，并通过使目标mRNA失去稳定性而发挥作用。大量研究表明miRNA可参与血管发生、脂肪分解与沉积、细胞增殖分化与凋亡等多个重要的生命过程，故关于   miRNA的研究普遍涉及动植物生长发育、内源激素分泌及疾病发生等一系列重要的生命活动。

2 miRNA对畜禽脂肪沉积的影响

2.1 miRNA在牛脂肪组织中的相关研究

Li等[1]在研究miR-21-3p是否可以调节奶牛乳腺上皮组织细胞（BMECs）中甘油三酯产生的试验中，用生物信息学方法推测miR-21-3p的靶基因，并发现BMECs中存在一种可以催化长链PUFAs反应的限速酶Elovl5，Elovl5是调控脂质代谢的重要基因。经生物信息学及双荧光素酶报告分析证实Elovl5的3′UTR端中确实存在miR-21-3p靶点。经后续转染试验发现，在转染miR-21-3p模拟物的BMECs中，甘油三酯含量被上调。同时，转染miR-21-3p抑制剂的BMECs中甘油三酯含量被下调，因此推测miR-21-3p通过靶向调控Elovl5来调控脂质代谢。Zhang等[2]通过比较转录组分析去势雄牛与未去势雄牛在相同情况下肌肉内脂肪（IMF）增加情况，发现IMF增加与miR-224和LPL基因表达异常有关，并预测miR-224可能靶向调控LPL基因的表达。用双荧光素酶报告基因试验分析转染了miR-224和LPL的293T细胞，证明了miR-224与LPL之间确实存在负向调控关系，且在LPL的3′UTR区域内有两个miR-224的结合位点，得出miR-224可通过靶向调控LPL基因来影响牛前脂肪细胞的成脂分化。此前，miR-454被广泛报道可参与细胞增殖、凋亡和癌症的发生发展，而Zhang等[3]通过一系列试验证实了miR-454可以与奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）中的PPAR-γ（脂肪细胞形成的主要调节器）的3′UTR靶位点特异性结合，过表达的miRNA-454会使PPAR-γ的表达下调，会降低脂滴的积累和甘油三酯的产生，即miR-454负向调控牛乳腺上皮细胞PPAR-γ基因的表达来进一步调控脂肪细胞的生成。Ma等[4]发现bta-miR-130a和bta-miR-130b可以与其靶基因PPARG和CYP2U1的3′UTR端结合。bta-miR-130a/b被认为是脂肪細胞分化的负调控因子，它的表达会抑制脂肪调控基因PPARG的表达，而促进CYP2U1的表达，从而对肉牛脂肪细胞的增殖分化起调控作用。邵静等[5]以延边黄牛为研究对象，对阉牛和公牛背最长肌组织中存在表达差异的基因和miRNA进行分析，并经qRT-PCR技术验证，得出miR-27可以通过调控ABAT、ATP6V0D2等基因来参与肌肉组织中糖、脂肪、蛋白质和能量等物质代谢途径来调控脂肪代谢。除此之外， miR-27也被证实可以与奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）靶向结合，从而对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪的合成起潜在调控作用[6]。Wang等[7]基于EST（表达序列标记）和GSS（基因组调查序列）以及牛保守miRNA的联合检测方法，发现miR-143、miR-145、miR-2325c 和 miR-2361在牛肌肉和皮下脂肪中有较高的表达，且4种miRNA在肌肉和皮下脂肪中的差异表达主要通过MAPK信号通路、WNT信号通路和TGF信号通路3种途径来发挥作用。Sun等[8]在对不同发育阶段（胎牛、成年牛）的牛背部脂肪中存在表达差异的miRNA进行试验分析时，发现bta-miRNAn25 和 bta-miRNAn26在牛背部脂肪组织中有明显的表达差异，表明它们可能会在牛的脂肪组织生长发育过程中起关键作用，并且推测其可能是遗传学和育种的潜在分子标记物。

2.2 miRNA在羊脂肪组织中的相关研究

Zhou 等[9]对比了绵羊肌肉组织中共815个miRNAs，其中539个miRNAs在哈萨克斯坦绵羊（KS）和西藏绵羊（TS）脂肪组织中均有表达，并且有179和97个miRNAs在KS和TS中是特异表达的。进一步研究发现miR-125a-5p是ESRRα的靶向调控序列，而ESRRα可以抑制前脂肪细胞的分化。Pan等[10]通过对羊皮下脂肪组织块进行试验，得出miR-124-3p可以靶向结合C/EBPα mRNA的3′UTR的3个蛋白位点，直接抑制绵羊位于脂肪组织中具有脂肪生成能力基质血管部分（SVFs）的脂肪分化。Byrne等[11]通过对印记基因簇PEG11的研究发现，其可以编码miR-431、miR-433、miR-136、miR-127和miR-432，且PEG11过表达会导致肌肉肥大，如果使miR-433和miR-431的表达同时上调，便会抑制脂肪的生成。Zhao等[12]从3日龄山羊颈皮下脂肪组织中分离出其前脂肪细胞进行试验分析，得出miR-183可直接靶向Smad4的3′UTR，通过抑制Smad4而正向调控山羊脂肪细胞的脂肪生成，而Smad4的抑制表达显著促进了山羊前脂肪细胞的分化。Ma等[13]发现miR-25的表达与泌乳量呈负相关，并确定miR-25可以与脂质生成的关键调控因子——过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1（PGC-1beta）3′UTR的3个特定位点靶向结合，而过表达的miR-25可导致PGC-1beta的表达受到抑制，进一步抑制某些脂肪基因的表达和甘油三酯的形成以及脂滴的积累。Chen等[14]发现miR-30e-5p和miR-15a在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中具有特异性表达。miR-30e-5p与miR-15a均可靶向结合LRP6，共同抑制LRP6的表达，促进GMEC中的脂肪代谢，并得出结论，miR-30e-5p和miR-15a通过影响LRP6和YAP1表达的途径而协同调控山羊乳腺上皮细胞的脂肪酸代谢。Wang等[15]证明了miR-145可以直接靶向调控存在于山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中的脂质相关基因启动子INSIG1，这是存在于内质网上的一种跨膜（多面体）蛋白质，通过在内质网中保留SREBFs并阻止其在高尔基体中的蛋白质水解激活来调节脂质合成FA的过程，进而有效调控脂肪生成基因的表达，进一步调控GMEC中脂肪酸的合成和脂肪的沉积。

2.3 miRNA在猪脂肪组织中的相关研究

众所周知，低睾酮水平会导致人类和动物的男性肥胖，即阉割会显著地导致胴体脂肪的积累，这便是商业猪肉一般是采用阉割公猪的原因之一。Wang等[16]通过试验解释了此现象。通过对比去势公猪与未去势公猪的特点，发现在去势猪的背部脂肪中MARK4蛋白质水平高于未去势猪，且去势公猪ssc-miR-7134-3p水平明显低于未去势公猪。进一步试验发现ssc-miR-7134-3p可以靶向结合MARK4编码序列（CDS）区域中的两个特异位点，从而对MARK4的表达起负调控作用，而MARK4可能通过抑制p38MAPK磷酸化而促进去势公猪的脂肪积累。Li等[17]通过对藏猪与大白猪肝脏的miRNA表达序列差异进行比较，发现共有6个存在表达差异的miRNA（miR-34a、miR-326、miR-1、miR-335、miR-185和miR-378），且其均可参与糖、脂质代谢。在西藏猪的肝脏中，低水平的miR-34a可能通过增加Sirtuin 1（Sirt1）型的表达而促进糖异生;低表达水平的miR-1可增加肝脏X受体α（LXRα）的表达，从而促进脂质的合成和积累;miR-185可以通过增加B类Ⅰ型“清道夫”受体（SR-BI）的表达，而促進血液中胆固醇的吸收和胆汁的分泌从而进一步影响脂肪沉积。Taniguchi等[18]通过用miR-33b转染猪皮下脂肪前细胞（PSPA）观察到脂肪分化延迟和脂肪积累减少的现象，即miR-33b可通过EBF1-C/EBPα和PPARγ通路而抑制脂肪合成基因的表达， 影响皮下前脂肪细胞（PSPA）的分化和发育，进而推迟脂肪分化并降低脂质沉积速度。Mentzel等[19]发现肥胖猪皮下脂肪组织中的miR-9和miR-124表达量高于普通水平且有显著上调现象，推测miR-9和miR-124与脂肪细胞中脂质的沉积有关。Liu等[20]通过对原代猪前体细胞试验，发现miR-375可以对猪前脂肪细胞内源性骨形态发生蛋白质受体（BMPR2）进行靶向调控，且沉默的BMPR2与过度表达的miR-375在脂肪的分化方面具有相同的抑制作用。其证明了miR-375是猪原代前体脂肪分化的负调节因子，并可对猪脂肪的分化产生影响。Ji等[21]在Solexa测序结果中发现miR-125a在成年猪背膘中表达较高。并且发现过表达的miR-125 a可以大大抑制脂肪生成标记物PPARγ、LPL、aP2基因的mRNA表达，并且还会通过影响目标基因ERRα的表达，导致脂质积累显著减少。从而得出结论，ERRα可以在miR-125a的靶向调控下抑制猪前脂肪细胞的分化。Du等[22]发现在猪肌肉前脂肪细胞中存在两个miR-125a-5p的靶基因。在脂肪细胞分化过程中，miR-125a-5p可与靶基因克虏伯类因子3（KLF13）的靶位点特异性结合，影响细胞分化;在猪肌肉内脂肪发生过程中可与特异性脂肪酸组成的调节因子脂肪酸延长酶6（ELOVL6）结合，调控脂肪生成。结果表明miR-125a-5p可能是一种新型的调控猪肌肉内脂肪生成和猪IMF脂肪酸组成的调控因子，且与猪肌内脂肪沉积呈负相关。Liu等[23]使用miRNA测序（miRNA-seq）技术分析了约克郡猪（YY，瘦肉型）和中国皖南花猪（WH，脂肪型）的背最长肌中的miRNA，发现miR-196a/b（miR-196a，miR-196b-5p）的表达差异明显，且其在WH中表达量最高，故推测miR -196a/b可能通过刺激脂肪细胞因子信号通路，促进猪背最长肌组织的脂肪生成。

2.4 miRNA在禽类脂肪组织中的相关研究

邵芳等[24]利用生物信息学技术，筛选出了与脂质代谢有关且其3′端的2～8位可与miR-33完全互补的候选靶基因CHPT1，将miR-33过表达载体和CHPT1荧光素酶报告载体共转染到小鼠的成肌细胞系C2C12中培养，发现如果miR-33与CHPT1的预测靶位点结合，则CHPT1基因的表达便会受到抑制，即得出miR-33可以通过对CHPT1基因的负调节作用来调节禽类脂质代谢。Liu等[25]发现鹅在短时间内过量摄入食物会导致严重的肝脂肪变性，通过进一步试验发现，在肝脏、脂肪和肌肉中miR-29c的表达被全面抑制，为了验证miR-29c的功能是否与鹅肝组织变性有关，预测了3个靶基因（即参与能量稳态或细胞生长的Insig1、Sgk1和Col3a1）通过双荧光报告系统等体外试验对其进行验证，最后得出miR-29c可能通过其靶基因调控能量稳态和组织生长，促进鹅对严重肝脂肪变性的耐受，从而对脂肪的代谢与沉积产生影响。Zhang 等[26]在对鸡进行与其肉质相关的miRNA分析试验中，测量鸡两个不同生理阶段的肌肉内脂肪（IMF）含量，整合分析miRNA-Seq和RNA-Seq数据，并建立鸡肌内脂肪细胞分化模型。通过荧光素酶报告分析、miRNA过表达和油红O染色试验明确gga-miR-140-5p在肌内脂肪的靶点，且证明了gga-miR-140-5p能够利用靶向类视黄醇X受体γ而促进肌内脂肪细胞分化。Fu等[27]对不同日龄的固始鸡乳腺肌肉组织中存在显著表达差异的miRNAs进行KEGG通路分析以显示代谢途径，并构建与乳腺肌肉发育和IMF沉积有关的miRNA-mRNA相互作用网络，最终发现gga-miR-103-3p和gga-miR-138-2-3p可能对鸡肌内脂肪的沉积起关键作用。

3 miRNA在畜禽遗传育种方面的应用

畜禽的育种不仅可以根据其表观性状进行选育，其体内具有调控作用的基因更应该作为重要的参考。基因种类及表达水平的不同決定了性状的不同。目前，已确定功能存在于畜禽的miRNA较多，这为畜禽的繁殖育种提供了重要的参考并奠定理论基础。充分了解畜禽各组织器官中基因信号通路及生物学过程的调控机制，有助于了解畜禽性状特点及规律。试验证明多数miRNAs对畜禽的不同部位（如乳腺的上皮组织、肌内脂肪组织、皮下脂肪组织等）的脂肪代谢与沉积都有一定的调控作用。例如存在于奶牛的乳腺上皮细胞（BMECs）中的miR-21-3p、miR-454和miRNA-27;存在于羊乳腺上皮细胞（BMECs）中miR-30e-5p、miR-15a和miR-145都对乳腺中脂肪的代谢与沉积有不同的调控作用;存在于牛肌内脂肪的miR-224，存在于皮下脂肪的miR-143、miR-145、bta-miRNAn25和bta-miRNAn26等;存在于猪肌内脂肪细胞中的miR-125a-5p，和脂肪细胞中促进分化的miR-33b、miR‐375、miR-125a-5p等;调节禽类脂肪代谢的miR-33、gga-miR-103-3p和gga-miR-138-2-3p等，这些存在于畜禽脂肪中的miRNAs对于畜禽自身而言可以不同程度地调控其脂肪的分化与沉积，同时这些miRNAs也可以作为标记辅助因子，对优质畜禽品种的选育及畜禽品种改良优化都发挥重要的参考和指导作用。进一步了解这些特性miRNA背后的分子机制，将为优化牛羊的乳质和畜禽的肉品质提供重要的思路，还有助于改善其泌乳性能并优化其产肉性能。从整体来看，畜禽的miRNA研究为畜禽的遗传选育提供了重要参考。

4 小结

关于机体组织miRNA种类和功能的检测主要包括机体细胞的分离、体外细胞培养与分化、靶基因的预测、双荧光素酶报告分析、油红O染色、靶基因的转染验证试验、实时定量荧光PCR和蛋白质免疫印迹分析及统计分析等基本步骤。由于miRNA功能的重要性及其检测方法的普及性，目前，有关miRNA种类和性能的研究非常广泛，机体组织中被证实功能的miRNA也层出不穷，不仅涉及植物病症研究和性状调控，也涉及动物研究，包括疾病原因的探讨，机体皮毛、器官、肌肉、脂肪等生长的调控机制，产奶产蛋性能的调控，遗传繁殖质量及数量的调控等。具有不同调控作用的miRNAs不仅可以作为动物体质评定及性能评定的有效依据，同时在育种工作方面也有重要指导作用。由于在不同种动物或同种动物的不同年龄阶段以及同年龄阶段但具有不同形态特征的同种动物，其机体内的miRNA种类或同种miRNA的表达都存在一定的差异，故miRNA的未知领域仍很宽广，需科研工作者进一步发现与验证。

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