初威澄 毛雪飞 刘霁欣 李春生

摘 要：以Teflon-AF材质的液芯波导管为核心部件，构建了负压液芯波导增强型拉曼检测系统，可以高效消除液芯光路中液体样品的气泡干扰，有效保障液芯波导长光程的拉曼增强作用。在此基础上，开发了功能饮料中食品添加剂山梨酸钾的现场快速检测方法，最低检出限（LOD）为0.05g/kg，加标回收率在98%～105%之间。同时，为了进一步降低负压液芯波导增强型拉曼检测系统对山梨酸钾的LOD，本研究利用冷冻富集技术对样品进一步浓缩，加入20.5g/kg氯化钠后，经过静态冷冻30min、离心冷冻10min的冷冻富集处理，山梨酸钾的LOD可以达到0.005g/kg，方法的日内和日间稳定性（RSD）在3%～4%之间，实际样品检测的加标回收率在94%～106%之间。

关键词：负压;液芯波導增强;山梨酸钾;功能饮料;冷冻富集

山梨酸钾是一种高效、低价的防腐剂，常在食品、饮料生产过程中作为食品添加剂使用。在安全用量内摄入山梨酸钾，不会对人体健康产生影响，但是过量服用可能导致化学性肺炎等问题[1]。我国在GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定，饮料中山梨酸钾的含量不得超过0.5g/kg（以山梨酸计）。然而，在实际的食品、饮料生产加工过程中，山梨酸钾的滥用、过量使用问题时有发生，这对消费者健康构成了潜在威胁。因此，快速、准确地测定饮料中山梨酸钾含量，是食品安全检测工作的重要内容。目前，山梨酸钾的检测方法主要有高效液相色谱法[2-3]、紫外分光光度法[4]和分子荧光光谱法[5-6]等，需要耗时、费力的样品前处理，以及大量的有害试剂，同时使用的仪器体积大、成本高，难以实现快速检测。

拉曼光谱法是利用拉曼散射效应对与入射光频率不同的散射光谱进行分析的方法，具有无损耗、快速等优点，易于实现仪器的小型化和现场化[7-9]。但是，拉曼散射的强度很弱，通常只有10-10～10-4，这导致拉曼光谱的信号较弱，分析灵敏度低，难以直接用于微量成分的检测[10]，如傅立叶变换拉曼光谱法、表面增强拉曼光谱法及光纤增强拉曼光谱法等。傅立叶变换拉曼光谱法多使用1 064nm 近红外激光作为激发光源[11]，这使得其在很多领域受到了应用限制。表面增强拉曼光谱可以实现数个数量级的信号增强[12-13]，如杨宇等[14]检测山梨酸钾的检出限（LOD）为0.180 7g/kg。但是，表面增强方法配比增敏胶体的操作要求较高，且表面增强拉曼光谱的稳定性不佳、重现性较差。光纤增强拉曼光谱法是基于全反射原理的拉曼光谱信号增强方式，有光子晶体光纤增强法[15-16]、液芯波导增强法[17-19]等形式，二者的区别仅在于对应增强器件分别为光子晶体光纤与液芯波导管。其中，液芯波导管的结构简单、成本较低，而且具有管壁透明、可盘曲性好等特点，在诸多领域得到了应用。但是，光纤增强拉曼光谱法最大的技术瓶颈在于光路中的气泡会严重干扰拉曼光的传播[20-21]，而这在溶液样品进样过程中是极难避免的，这极大阻碍了光纤增强拉曼光谱技术在实际样品分析中的应用。

另外，为了进一步降低拉曼光谱技术在实际检测时的LOD，常对液体样品中的待测物质进一步浓缩处理。其中，冷冻浓缩是近年来发展迅速的一种富集方式，其原理是利用稀溶液与冰在冰点以下的固液相平衡关系来实现富集[22-24]。由于该技术在低温常压下操作，分子物质不易分解，绿色、无污染，同时可以添加氯化钠（NaCl）等盐类促进待测组分从冰中析出，进一步提高预富集倍数[25]。

针对上述问题，本研究构建了新型的负压拉曼光谱检测系统，以Teflon-AF材质的液芯波导管为核心部件，并利用管壁材质的通透性，通过管外负压来消除内管气泡干扰，以达到现场快速检测的目的。同时配合车载冰箱，以冷冻浓缩方法对待测样品进行富集，对低浓度的样品进行检测，研究市售功能饮料中山梨酸钾含量的定量检测方法，提供一种车载实验室的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山梨酸钾标准物质（纯度99.0%），北京世纪奥科生物有限公司;5种功能饮料，购买于北京;超纯去离子水（TTL-30B型超纯水仪），北京同泰联科技发展有限公司;NaCl（纯度为99.0%），北京华奥宝生科技有限公司;乙二醇（纯度为96.0%），北京百灵威科技有限公司;实验中所用溶液在进入检测平台之前均经滤膜（0.22μm，津腾针式过滤器）过滤后进行上机检测。

1.2 仪器与设备

激光器（Laser785-5HSB），上海如海光电科技有限公司;检测探头（RPB-785-1.5-SS），上海如海光电科技有限公司;拉曼光谱仪（KIT21），美国Ocean Optics Inc公司;液芯波导管（Teflon AF 2400，长度20cm、外径406μm、内径229μm），美国DuPont公司;车载冰箱（-18℃），德国Alpicool公司;小型离心机（Mini Centriguge 7000），美国SCILOGEX公司。

1.3 负压拉曼检测系统

检测系统如图1所示，激光器的激发波长为785 nm，激光通过检测探头聚焦于液芯波导管端口，通过进样程序控制电磁阀1、电磁阀2和真空泵的工作状态，利用负压将待测样品导入液芯波导管（液体流向如图1箭头所示，详细流程见表1），之后利用真空泵进行负压脱气检测，背散射方式由同一检测探头采集待测物质激发产生的拉曼光谱信号，并传送至拉曼光谱仪进行数据记录和分析。检测完成后，检测溶液流入废液瓶中。

1.4 样品的冷冻富集

取8 mL功能饮料样品，加入设定量的NaCl;采用同样的方法，以水为基质配制空白溶液，并配置不同山梨酸钾含量的标准溶液。待NaCl完全溶解后，将溶液移入1.5 mL离心管中，为防止因冷冻时体积膨胀挤破管盖，每个离心管中仅加入1mL溶液。首先，将各溶液浸入预冷冻4 h以上（-18℃车载冰箱）的乙二醇中进行静态冷冻，静态冷冻一定时间后，将离心管转入放置在车载冰箱中的小型离心机中进行冷冻离心，经过一定时间后，立即取出离心管并刺破离心管底部，使富集后的溶液流入检测后的检测试管中。

1.5 光谱采集

样品通过负压拉曼进样系统导入后进行检测，激光器和拉曼光谱信号采集参数为：激光功率为500 mW，采集积分时间为1s（n=1），采集的拉曼光谱曲线经背景的扣除后，再对光谱数据进行平滑处理并测量其峰高和峰面积。

2 结果与分析

2.1 负压力与信号稳定时间

由于液芯波导管直接导入液体样品时存在气泡干扰，因此，本研究的液芯波导系统依靠真空泵产生的负压力来实现待测样品的脱气，实现有效和稳定的检测。为了提高检测效率，在最短时间内实现脱气检测，需要优化液芯波导系统的负压值。本工作在导入0.5g/kg的山梨酸钾标准溶液后，控制第三步脱气段（表1）真空泵的负压参数，以测试不同负压值条件下山梨酸钾溶液信号达到稳定所需的时间。

由圖2可知，当负压的绝对值降低时，信号稳定所需的时间增长，这与液芯波导管脱气的原理是一致的;当压力值在-20k～-60kPa时，平衡时间随压力的降低而显著减少;当压力值在-60k～-90kPa时，这一趋势明显变缓;当压力值小于-90kPa时，稳定时间变化较小。考虑到检测系统中的液芯波导管的壁厚为177μm，机械强度较低，为避免检测过程中液芯波导管结构产生形变，最终选择负压环境为-90kPa。

2.2 山梨酸钾拉曼特征位移的确定

拉曼光谱能够得到待测分子的振动信息，因为不同的化学键对应着不同的振动方式，因此产生了不同的拉曼光谱。在利用拉曼光谱对山梨酸钾进行定量分析之前，需要确定山梨酸钾的拉曼特征峰，用于定性分析。配制浓度为0、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0g/kg的山梨酸钾标准溶液，两次检测间隔仅为5min。从图3可以看到，山梨酸钾拉曼光谱信号主要集中在1 100～1 800 cm-1内，其中1 143、1 278、1 381、1 637 cm-1位移处有特征峰出现，并随着浓度的变化呈线性规律变化，因此可以作为山梨酸钾的特征拉曼位移。虽然在其他位置也有拉曼特征峰出现，但由于信噪比较低，并不适用于实际分析;相比之下，在1 637 cm-1位移处特征峰的信噪比最高，最终选择1 637cm-1为定量分析的特征拉曼位移。

2.3 静态冷冻时间对冷冻富集的影响

冷冻富集可以有效地提高进样溶液中待测物质的溶度，从而提高方法的最低检出能力。为了提高检测效率，缩短样品处理时间，本研究对山梨酸钾溶液样品的冷冻富集条件进行了优化。首先，将待测样品直接进行静态冷冻，结果表明，冷冻时间在40min左右时待测样品可被完全冻结，基本无液体剩余，无法达到富集的效果。另一方面，参考NaCl和水的相图[15]，当水溶液中存在一定浓度的NaCl时，可以有效地避免溶液被完全冻结，故又加入20.5g/kg的NaCl后按上文方法进行冷冻实验，结果确实有部分溶液未被冻结，但这些溶液主要被封存在冰块的间隙中，难以取出，无法进行后续检测。

为了进一步解决这一问题，本研究考虑对待测样品依次进行静态冷冻和的离心冷冻，通过离心力使冰块始终冻结在溶液上方，并对其时间进行了优化。具体操作为：向待测溶液中加入一定量的NaCl，待测山梨酸钾溶液的浓度为0.5g/kg，分别经0、10、20、30、40min的静态冷冻，再经过离心冷冻至达到固液平衡，结果显示，上述不同静态冷冻时间下对应的离心冷冻时间分别为>4 h、1h、30min、10min、0min，说明静态冷冻由于热传递更为充分，冷冻速度更快。但当静态冷冻时间为40min时，离心管内部几乎完全被冰填满，富集后的溶液完全被封存在冰块的间隙中，不便取出，故冷冻最终阶段使用离心冷冻以防止富集后溶液无法取出;而静态冷冻时间小于30min时，整个处理的时间较长。综合考虑冷冻效果和处理时间，最终选择30min左右的静态冷冻和10min离心冷冻处理。对静态冷冻时间做了进一步优化（静态冷冻时间分别为24、27、30、33、36min，离心冷冻时间为10min），同时采用ICP-OES检测富集前后钠离子的浓度比，以验证溶液的冷冻富集倍数，再通过本研究中使用的负压液芯波导增强型拉曼检测系统验证山梨酸钾的富集倍数，最后，计算富集前后溶液的体积比并与两种富集倍数相比较，以寻求一个简单的富集倍数计算方法。由图4可知，静态冷冻时间在24～30min时，各项比值均随静态冷冻时间的增加而增大，说明在这段时间内，尚未达到NaCl浓溶液和冰的平衡点;在30～33min时，各项比值基本趋于稳定，而且NaCl含量接近该温度下的饱和浓度，证明在这段时间内达到了NaCl浓溶液和冰的平衡点，其中30min时各项比值相差较小，证明静态冷冻为30min时可以用富集前后的液体的体积比代替山梨酸钾溶液的浓度富集倍数。静态冷冻为36min时，虽然体积比很大，但是钠离子富集倍数与山梨酸钾富集倍数与之相差很多，可能是已经有部分液体被封存在冰块中所造成的。因此，最终选择静态冷冻时间为30min、离心冷冻时间为10min。

2.4 氯化钠浓度对富集前后的浓度比的影响

待测样品中NaCl的浓度（CNaCl）对溶液的富集倍数（Ck）有一定的影响，其原理可从NaCl与水的相图中得知。如图5所示，在相同温度下，NaCl的含量越高，溶液中冰的比例就越少，即富集倍数越低。本研究取5种待测功能饮料样品，山梨酸钾的加标浓度为0.5g/kg，加入不同量的NaCl配制成混合溶液（NaCl浓度分别为11.7、14.6、17.6、20.5、23.4g/kg）。使用负压液芯波导拉曼光谱系统测定上述处理溶液中山梨酸钾的含量。由图5可知，待测样品中NaCl的浓度越大冷冻富集倍数越小。当待测溶液中NaCl浓度为20.5g/kg时，富集倍数在10倍左右;而NaCl浓度小于20.5g/kg时，虽然富集倍数较高，但是富集后剩余液体量过少（少于600μL），溶液取出困难，因此不予选择。各检测溶液的富集浓度比存在一定差异的原因可能是待测溶液中含有不同量的碳水化合物等物质，同样会影响溶液冰点。因此，实验中NaCl浓度在-18℃冷冻时略小于NaCl和水的相图[15]中所对应的浓度数值（图5中1mol/L对应58.5g/kg）。最终选择在待测溶液富集前添加20.5g/kg的NaCl作为处理条件。

2.5 方法检出限

依据图3计算冷冻富集前的工作曲线，由于1 637 cm-1处信噪比最高，故选取该波数作为定量分析的拉曼光谱位移数。按照公式3Sb/k计算LOD[3]，其中Sb为测定11次试剂空白所得到数值的标准偏差，k为标准曲线线性方程的斜率。最终，得到该位移处的仪器检出限为0.05g/kg，标准曲线（山梨酸钾浓度分别为0、0.05、0.1、0.5、1g/kg）的R2为0.998 9，其检测的拉曼光谱信号如图2所示。考虑到10倍的富集系数，冷冻富集方法的LOD为0.005g/kg，按照冷冻富集前处理的标准曲线R2为0.990 8。

2.6 方法重现性

稳定性是评价检测方法可靠性的重要指标，本研究测定1 637 cm-1特征位移值下0.5g/kg山梨酸钾溶液，并按照冷冻富集的实验方法以及优化后的参数操作，连续7次进样，以评价方法的7d的日内稳定性，计算其RSD分别为2.8%、2.3%、2.5%、3.2%、2.9%、3.0%、2.8%，从而证明该方法在对山梨酸钾检测时，具有良好的重复性。对日间稳定性进行评估，取每日7组实验的平均值，同样以波数为1 637 cm-1处的特征峰为检测对象，计算日间重复性RSD为4.0%。表2结果表明，冷冻富集负压液芯波导拉曼光谱法测定山梨酸钾具有较好的重现性。

2.7 加标回收率

本研究对5种功能饮料（标号1～5）并以国家标准限量值（0.5g/kg）进行加标回收检测，按照实验方法与上文优化后的实验参数检测待测溶液，并以1 637 cm-1的特征峰为检测对象。由表3可知，经过冷冻富集的样品的回收率在94%～106%之间，未经过冷冻富集的样品的回收率在98%～106%之间，表明直接进样或者经冷冻富集后的负压液芯波导拉曼光谱法，对真实饮料样品中山梨酸钾含量的测定具有良好的准确度。

3 结论

本研究以Teflon-AF材质的液芯波导管为核心部件，构建了负压液芯波导增强型拉曼检测系统，可以快速高效地消除液芯光路中液体样品的气泡干扰，有效保障液芯波导长光程的拉曼增强作用。在此基础上，开发了功能饮料中食品添加剂山梨酸钾的现场快速筛查方法，直接进样检测山梨酸钾的最低LOD为0.05g/kg，加标回收率在98%～106%之间。同时，为了进一步降低负压液芯波导增强型拉曼检测系统对山梨酸钾的LOD，本研究利用冷冻富集技术对样品进一步浓缩，加入20.5g/kg NaCl后，经过静态冷冻30min、离心冷冻10min的冷冻富集处理，山梨酸钾的LOD可以达到0.005g/kg，方法的日内和日间稳定性（RSD）在3%～4%之间，实际样品检测的加标回收率在94%～106%之间。本研究首次将负压液芯波导增强型拉曼光谱分析技术应用于山梨酸钾的实际样品分析，可以快速测定功能饮料样品中山梨酸钾的含量，既满足了现场快速筛查的需要，也可以实现低含量样品的准确分析，将为市场环节中食品添加剂的食品安全监管工作提供一种快速、有效、可靠的分析技术手段。

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Abstract：A liquid core waveguide made of Teflon-AF was used as the core component.A negative pressure liquid core waveguide enhanced Raman detection system was constructed，which could quickly and efficiently eliminate the bubble interference of liquid samples in the liquid core optical path and effectively guarantee the liquid core waveguide Raman enhancement of long light path.Based on this，a rapid on-site detection method for potassium sorbate as a food additive in functional beverages was developed.The minimum detection limit （LOD）was 0.05g/kg，and the standard recovery was 98%～105%.At the same time，in order to further reduce the LOD of potassium sorbate in the negative pressure liquid core waveguide enhanced Raman detection system，the sample was further concentrated by freezing enrichment technology.After adding 20.5g/kg sodium chloride，the sample was frozen for 30min.After centrifuging and freezing for 10min，the LOD of potassium sorbate could reach 0.005g/kg，and the intra-day and inter-day stability （RSD）of the method was 3%～4%.The spiked recovery of the actual sample detection was 94%～106%.

Keywords：negative pressure;liquid core waveguide enhancement raman spectroscopy;potassium sorbate;functional beverage;freezing pre-concentration

（責任编辑 唐建敏）