刘静 汪雨 黄劲松

摘要：为了进一步开发我国传统中草药中的活性和保健成分，以池州山区野生灵芝为研究对象，通过水热提取和乙醇沉淀，采用单因素和三水平三因素正交表L9（34）设计试验，经分析计算确定灵芝多糖的最佳提取工艺条件为提取温度80 ℃，浸提时间35 min，料液比1∶20，提取3次，灵芝多糖的提取率可达到5.45 mg/g;经红外光谱图分析，多糖为β -吡喃葡聚糖。

关键词：灵芝;多糖;提取;正交;池州;提取率

中图分类号：TQ461      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.037

Abstract：In order to further develop traditional Chinese herbal medicine and health care ingredients，Chizhou Ganoderma lucidum as the research object in our study，by hot water extraction and ethanol precipitation，using the 3 factors of single factors and three levels orthogonal table L9（34） design of experiment，the analysis and calculation to determine the optimum ext-raction conditions of Ganoderma lucidum polysaccharide，temperature 80 ℃，the leaching time of 35 min，and solid-liquid ratio 1∶20，extracting 3 times，the yield of Ganoderma lucidum polysaccharide reached 5.45 mg/g. The polysaccharides were determined by IR spectra，shows that was β-pyran glucan.

Key words：Ganoderma atrum;polysaccharose;extract;orthogonality;Chizhou;extraction

灵芝是我国的宝贵中草药文化遗产，含有多种活性成分，对灵芝活性成分研究不但可以提高我国中草药利用价值，还可以发扬传统优秀文化在当代的价值[1-3]。灵芝多糖具有抗肿瘤作用，灵芝多糖可以通过促进白细胞介素Ⅱ的生成，通过促进单核巨噬细胞的吞噬功能，通过提升人体的造血能力尤其是白细胞的指标水平，以及通过其中某些有效成分对癌细胞起到抑制作用，成为抗肿瘤及癌症辅助治疗的优选药物[4-6]。研究结果表明，灵芝多糖的抗肿瘤活性可能与其对宿主机能的影响有关，且水溶性多糖也可能起着很重要的作用，并且灵芝多糖有其合适的分子量范围，它的分子量越大，抗肿瘤活性越强[7-9]。此外，灵芝多糖具有一定的免疫调节功能，经腹腔注射或经口服灵芝多糖，能增强对蛋白质抗原延迟超过敏化[10]。灵芝多糖能促进T淋巴细胞的转化而增强细胞免疫力;促进淋巴细胞的形成反应，从而增强体液免疫力;增强淋巴细胞内DNA聚合酶的活性，促进细胞的增殖、分裂，导致白细胞介素的合成和分泌，从而恢复因衰老而导致的免疫力下降。再次，灵芝多糖有保护心脑血管的功能[11-12]。研究结果表明，灵芝多糖有明显的强心降压作用，对动脉粥样硬化有预防和治疗作用;其降低血糖原理可能是由于血浆胰岛素水平被提高，使葡萄糖的代谢速度加快，外周组织和肝的葡萄糖利用也加快，从而达到血糖降低的作用。还有研究表明，灵芝多糖可有效地扩张冠状动脉，增加冠脉血的流量，改善心肌微循环，加强心肌氧和能量的供给，可明显使血胆固醇、甘油三酯和脂蛋白降低，可以防止动脉粥样硬化斑块的形成[13-16]。

灵芝多糖能促进血清、肝脏和骨髓的核酸及蛋白质的生物合成，因此可以有效地抗病毒;灵芝多糖可显著提高SOD活性，有效清除机体产生的自由基，从而阻止自由基对机体的损伤，防止机体的过氧化，保护了细胞组织，延缓了细胞衰老。灵芝多糖能显著促进细胞核内DNA合成能力，并可增加细胞的分裂代数[17-19]。这些作用都能延缓机体的衰老，所以，灵芝多糖的抗衰老功能十分强大。除了具有上述保健功能外，还有其他的药用效果，如平缓咳嗽、化痰止咳，缓解支气管哮喘症状、慢性支气管炎。可使过敏反应介质的释放被阻断，使过敏反应减轻;对于中枢神经系统有较强的调节作用，可以安神补脑，保证良好的睡眠质量;可以使其他降压药物的效果更延长和稳定。灵芝多糖还可以保持和调节皮肤水分，恢复和保持皮膚弹性，使皮肤中黑色素的形成和沉淀的速度延缓[20]。

池州黑灵芝产于皖南山区，应用为保健食品已有2 000多年的传统，但是目前利用现代科学研究方法对其进行研究较少，从提取、结构等方面进行初步研究。

1   材料与方法

1.1   试剂和仪器

乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖、乙醚、石油醚、正丁醇、氯仿，以上试剂均为分析纯，国药集团上海试剂公司提供。

R201D型旋转蒸发器，上海广英仪器有限公司产品;WD750B型微波炉，顺德市格兰仕电器实业有限公司产品;Delta-320型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品;BSZ-100A型分部收集器、HL-1B型恒流泵，上海沪西分析仪器厂产品;SYC-15型恒温水浴锅，河北润联科技有限公司产品;WK-150A型超微粉碎机，济南达威机械有限公司产品;FTIR 8700型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司产品。

1.2   试验步骤

1.2.1   灵芝多糖的脱蛋白

采用Sevage法脱除蛋白。称取少量灵芝粉样品加少量水溶液（大约有10 mL），取样品液10 mL，加入氯仿-正丁醇（预先配成一定体积比的混合液比例为1∶4）2.5 mL，置于萃取装置中，充分振荡，取上层清液。反复脱蛋白3次效果最佳。

1.2.2   灵芝多糖的透析

（1）透析袋的处理。将透析袋放在装有50%的乙醇的热水中煮1 h，在蒸馏水中润洗。

（2）透析处理。将脱蛋白后的多糖液装入透析袋内，用夹子封口，然后将透析袋放入装有大量蒸馏水的大容器中，透析2～3 d，乙醇沉淀、离心、低温干燥，得到灵芝多糖。

1.2.3   灵芝多糖提取率的测定

采用分光光度法进行测定。多糖类成分在硫酸作用下，首先水解成单糖，同时迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成有色化合物，490 nm處有最大吸收波长[12]。

精密称取葡萄糖20 mg，定容于400 mL容量瓶中，配置成50 μg/mL。取上述溶液0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0，1.2 mL分别于6支试管中，加蒸馏水至2.0 mL，加入1.0 mL，15%苯酚溶液（苯酚与蒸馏水的比例为15∶85），摇匀后迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀后静置10 min，置沸水浴中加热15 min，迅速冷却至室温，以蒸馏水的反应液作空白，于波长490 nm处比色测定A值。以A490为横坐标，对应的糖量值为纵坐标做标准曲线。使用最小乘法做线性回归，得到吸光度（A）与葡萄糖质量浓度（C）的曲线。灵芝多糖提取率按以下公式计算：

称取灵芝多糖5.0 mg，加热水溶解后定容至100.0 mL，取2.0 mL按上述方法测定A490，查标准曲线，计算结果。

1.2.4   灵芝多糖的测定

粉碎50 g灵芝，由于灵芝多糖易溶于热水中，因此采用热水提取法。对于灵芝多糖的提取工艺，主要从以下4个因素来考虑对提取率的影响，为正交试验设计的水平提供有意义的取值范围。

（1）温度对灵芝多糖提取率的影响。称取1 g灵芝粉5份，加入30 mL水，置于温度不同的水浴锅中，控制温度分别为50，60，70，80，90 ℃，浸提30 min，过滤，滤液离心，苯酚-硫酸法测定灵芝多糖质量浓度，计算提取率。

（2）料液比对灵芝多糖提取率的影响。称取1 g灵芝粉5份，分别加入水15，20，25，30，35 mL置于80 ℃的水浴中，浸提30 min，过滤，滤液离心，计算提取率。利用苯酚-硫酸法测定灵芝多糖质量浓度。

（3）提取时间对灵芝多糖提取率的影响。称取  1 g灵芝粉5份，加入30 mL水，控制温度80 ℃，分别浸提20，25，30，35，40 min，抽滤，滤液经离心后用苯酚-硫酸法测定灵芝多糖质量浓度，计算提取率。

（4）提取次数对灵芝多糖提取率的影响。称取  1 g灵芝粉5份，加入30 mL水，控制温度80 ℃，分别提取1，2，3，4，5次，每次30 min，合并提取液，滤液离心，计算提取率。

2   结果与分析

2.1   提取温度对灵芝多糖提取率的影响

提取温度对灵芝多糖提取率的影响见图1。

由图1可知，伴随提取温度的升高，多糖的提取率渐渐升高，这表明温度越高对灵芝细胞的破坏作用越大，有利于多糖的浸出。由图1可知，提取温度为80 ℃时，灵芝多糖的提取率最高，因此最适宜提取温度为80 ℃。

2.2   料液比对灵芝多糖提取率的影响

料液比对灵芝多糖提取率的影响见图2。

随着料液比的增加，多糖提取率逐渐降低，料液比为1∶20，1∶25时，多糖提取率都为最大。而容积体积的增加会延长浓缩时间，能量消耗较大，生产成本增加，所以料液比为1∶20较好。

2.3   提取次数对灵芝多糖提取率的影响

提取次数对灵芝多糖提取率的影响见图3。

由图3可知，提取次数对灵芝多糖提取率的影响也较为突显。当提取次数1～3次时，多糖提取率增加较快;3～5次时，多糖提取率上升相当迟缓。此外，提取次数较多时，提取液较稀，浓缩过程能耗大。所以，提取次数选3次为宜，是从节约成本和提高效率的方面考虑的结果。

2.4   提取时间对灵芝多糖提取率的影响

提取时间对灵芝多糖提取率的影响见图4。

由图4可知，灵芝多糖提取率随着浸提时间的增加而逐渐增加，30 min后，提取率减少，而随着时间的延长，生产时间也相应延长，生产成本会增加，因此浸提时间为30 min。

2.5   水提法提取灵芝多糖的正交优化

因素与水平设计见表1。

通过单因素试验，利用三水平三因素正交L9（34）试验对工艺进行了优化。

灵芝多糖提取正交设计见表2。

按正交试验设计，共进行9次提取，各个因素影响灵芝多糖提取率的排列顺序为C>B>A，最佳的提取条件为C2B3A2，即提取温度80 ℃，提取时间35 min，料液比1∶20，灵芝多糖的提取率可达到5.45 mg/g。提取温度为80 ℃时，水分子运动剧烈，使灵芝多糖运动加快，灵芝细胞膨胀，细胞壁对多糖的束缚力减弱，多糖在胞内和胞外的渗透压差变大，溶液内外浓度平衡较快。提取时间低于35 min时，胞内外多糖没达到平衡;提取时间大于35 min时，较高的温度将破坏多糖，引起多糖降解。料液比大于1∶20时，溶液过稀，给后续浓缩带来困难;料液比小于1∶20时，胞内多糖浸出较困难。

2.6   红外光谱图鉴定

灵芝多糖的红外光谱图见图5。

由图5可知，在波长3 000～3 800 cm-1处出现一个较宽的糖分子内部或分子之间氢键O-H伸缩振动引起的峰[13]，2 950 cm-1处的吸收是亚甲基（-CH2）的C-H伸缩振动峰，1 637cm-1处应为-CHO的C=O伸缩振动引起的吸收峰，而1 390 cm-1处的尖锐峰可能为C-H变角振动，与2 950 cm-1处的吸收振动峰构成了糖类的特征吸收峰[14]。1 130 cm-1处的吸收峰可能为糖环的特征吸收峰，是由多糖中链接单糖的C-O糖苷键振动引起[15]。此光谱图表明所得产品是多糖。

3   结论

通过正交优化试验确定灵芝多糖的最佳工艺提取条件为提取温度80 ℃，提取时间35 min，料液比1∶20，提取次数3次，灵芝多糖产率可达到5.45 mg/g。在这些条件之中溫度的改变对多糖提取率的影响相对较大，其次是提取时间、料液比。目前，此方法仅限于实验室提取灵芝多糖，对其在体内的代谢及对细胞修复方面需进一步深入研究。

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