胡娅琪，秦 蓓，关 丽，贺茂芳，张育珍

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

硝基化合物在工业生产中应用广泛，是合成炸药、杀虫剂、除草剂及燃料等产品的重要化工原料。由于社会各个方面对其广泛的需求，且该类化合物及其在环境中转化的产物大多数是危险有毒的化学品；另外，硝基芳香化合物本身在环境中具有较高的稳定性、持久性和有毒性等特点[1]，因此对环境产生了严重的危害，造成了不可逆转的环境污染问题。由于硝基芳香化合物在哺乳动物体内易被转化为致癌性更强的亚硝基和羟氨基化合物，对人类本身的生活健康更是产生极大的威胁[2]。其中三硝基甲苯(TNT)作为硝基芳香化合物的代表物，更是对环境、健康具有较大的危害性。因此， TNT的检测是一个紧迫的科学问题[3]。

目前，在众多TNT的检测方法中，荧光分析法由于具有较高的灵敏度而受到广泛的应用，其中大多数是以有机染料分子、量子点为传感单元[4-7]。由于有机染料分子易发生光漂白现象导致稳定性较差，量子点的前驱体具有毒性，因此很有必要发展一种荧光性能稳定的探针用于TNT的分析检测。荧光金纳米簇和传统的有机染料分子、量子点相比，具有环境友好、荧光性质可调及表面易于修饰的优点。目前TNT的荧光传感器多为单信号探针，其容易受到环境影响而导致荧光信号受到干扰，而相对于单信号的输出，双信号的荧光传感器则克服了这个缺点。作者利用牛血清白蛋白还原法制备金纳米簇荧光探针，进一步将2-氨基嘌呤修饰到金纳米簇(Au NCs)表面合成荧光性能稳定的双信号荧光探针，并将该荧光探针应用于TNT的高灵敏检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白(BSA)：北京索莱宝生物科技有限公司；三水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)：上海韶远科技有限公司；2-氨基嘌呤(2-AP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝基苯(NB)、对硝基甲苯(DNT)、三硝基甲苯(TNT)、乙醇、丙酮：国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。

荧光光谱仪：Cary Eclipse，紫外分光光度计：Cary 60，美国安捷伦科技有限公司；傅里叶变换红外光谱仪：EQUINOX-55，德国布鲁克公司；透射电镜：JEM 2100F，日本电子株式会社。

1.2 BSA-Au NCs、2-AP/BSA-Au NCs的制备

BSA修饰的Au NCs(BSA-Au NCs)根据文献报道合成[8]，将5 mL 10 mmol/L的HAuCl4溶液(37 ℃)加入到5 mL 50 mg/mL BSA溶液(37 ℃)中，混合后在50 mL圆底烧瓶中37 ℃水浴搅拌5 min，再加入0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液，继续搅拌12 h，反应结束后得到的棕色溶液即为BSA-Au NCs，将其透析过夜，纯化后得到的BSA、Au NCs储存于4 ℃冰箱中备用。

2-氨基嘌呤修饰的Au NCs(2-AP/BSA-Au NCs)通过EDC/NHS交联反应制得，将5 mL 10 mmol/L的2-AP溶液加入到5 mL纯化备用的BSA-Au NCs溶液中，加入60 mmol/L EDC、NHS溶液，在50 mL圆底烧瓶中混合水浴中持续搅拌5 h，反应结束后得到的棕色溶液即为2-AP-BSA-Au NCs，将其透析过夜除去多余未反应的2-AP分子，纯化后得到的2-AP/BSA-Au NCs储存于4 ℃冰箱中备用。

2 结果与讨论

2.1 金纳米簇的表征

以BSA作为保护剂和还原剂合成了BSA-Au NCs，插图为自然光和紫外光条件下BSA-Au NCs图片,对其进行荧光光谱测试得到其激发(EX)和发射(EM)曲线，见图1。

λ/nm图1 BSA-Au NCs的荧光光谱图

由图1可知，BSA-Au NCs的最大激发波长为500 nm，最大发射波长为673 nm，发射红光，具有较大的斯托克斯位移(173 nm)。

BSA-Au NCs的透射电镜图见图2。

图2 BSA-Au NCs的透射电镜图

由图2可知，BSA-Au NCs平均尺寸为1.5 nm，具有良好的分散性。

将2-AP修饰在BSA-Au NCs表面后，通过荧光光谱测试研究了2-AP/BSA-Au NCs、BSA-Au NCs和2-AP发射光谱曲线的变化，见图3。

λ/nm图3 样品的荧光光谱图

由图3可知，2-AP的荧光发射峰在370 nm，BSA-Au NCs荧光发射峰位于673 nm，2-AP/BSA-Au NCs的荧光发射峰位于384 nm和643 nm。相对于前两者其荧光发射峰均有所移动，可能是由于2-AP的引入改变了BSA-Au NCs的配体，使其金核的电子转移有所改变，因此发光性质有所改变。

分别对BSA-Au NCs、2-AP、2-AP/BSA-Au NCs测定红外吸收光谱，见图4。

σ/cm-1图4 样品的傅立叶变换红外光谱图

2.2 条件优化

Au NCs和2-AP的浓度均会影响2-AP/BSA-Au NCs的荧光强弱，若2-AP浓度较低，BSA-Au NCs表面修饰的2-AP的分子数量有限，且部分2-AP分子的荧光会被Au NCs猝灭，导致2-AP/BSA-Au NCs荧光较弱。为了得到荧光较强的2-AP/BSA-Au NCs探针，在c(2-AP)=4 mmol/L对Au NCs交联进行了考察，在不同激发波长(从上到下依次为300、310、320、330、340、350、400 nm)条件下进行荧光光谱测试，见图5。

由图5可知，激发波长为300 nm时2-AP/BSA-Au NCs在384 nm和643 nm处的荧光强度最大。其中，图5b相对于图5a和图5c位于384 nm和643 nm处的荧光强度相对较大，说明BSA-Au NCs的浓度影响2-AP/BSA-Au NCs的荧光强弱。在浓度较低的情况下，即使有足够多的功能分子2-AP，但是通过交联修饰到Au NCs表面的分子较少而导致荧光较弱。在较高的浓度条件下，BSA-Au NCs会对2-AP的荧光造成一定的猝灭，因此BSA-Au NCs只有在合适的浓度下，既可以修饰数量较多的2-AP分子，又不会对其荧光信号造成衰减。因此，选择功能分子c(2-AP)=4 mmol/L,c(BSA-Au NCs)=13 μmol/L来进行交联反应制备2-AP/BSA-Au NCs荧光探针。

λ/nma c(BSA-Au NCs)=20 μmol/L

λ/nmb c(BSA-Au NCs)=13 μmol/L

λ/nmc c(BSA-Au NCs)=6 μmol/L

λ/nmd 激发波长为300 nm图5 BSA-Au NCs在不同条件下荧光光谱曲线

2.3 2-AP/BSA-Au NCs对TNT的荧光分析

TNT的引入可以有效地猝灭2-AP/BSA-Au NCs的荧光，因此可以应用于TNT的检测，2-AP/BSA-Au NCs与TNT作用前后的光谱曲线见图6。

λ/nm图6 加入10 μmol/L TNT前后2-AP/BSA-Au NCs的荧光光谱曲线

由图6可知，TNT由于苯环上硝基强烈的吸电子作用，导致TNT成为较好的缺电子体(即电子受体)，当富电子的荧光物质与TNT相互作用会发生荧光猝灭。基于TNT的缺电子性很多文献报道了多种传感器[9]，尤其是和氨基类的化合物以及一些荧光纳米材料。

基于文献报道及实验结果，认为TNT对2-AP/BSA-Au NCs的荧光猝灭效应可能是由于其强烈的缺电子性导致两者之间发生光诱导的电子转移反应，导致富电子的2-AP和BSA-Au NCs荧光均发生猝灭。基于此，构建了基于2-AP/BSA-Au NCs荧光探针的荧光分析新方法，进行TNT的分析检测，见图7。

图7 2-AP/BSA-Au NCs荧光探针对TNT的检测原理示意图

将TNT标准溶液加入2-AP/BSA-Au NCs分散液中在最优的条件下测定2-AP/BSA-Au NCs与不同浓度TNT作用后的荧光光谱曲线，从上到下依次为c(TNT)=0.2、0.5、1.5、3.2、4.0、6.0、10.0 μmol/L，并作标准曲线，见图8。

λ/nma 2-AP/BSA-Au NCs加入不同浓度TNT的荧光光谱图

c(TNT)/(μmol·L-1)b 标准曲线图图8 2-AP/BSA-Au NCs加入不同浓度TNT的荧光光谱图和标准曲线图

由图8可知，随着c(TNT)逐渐增大(从0.2 μmol/L到10.0 μmol/L)，探针在384 nm和643 nm处的荧光强度随之降低，证明TNT能够不同程度地将探针的荧光猝灭。通过荧光探针分别在643 nm和384 nm处的荧光强度变化[(I640-I380)/100]作为标准来衡量TNT对双信号荧光探针的猝灭程度。发现当c(TNT)=0.2～6.0 μmol/L，双信号荧光探针的(I640-I380)/100信号变化与c(TNT)呈良好线性关系，相应回归方程及相关系数分别为y=-0.211 18x+ 3.407 03，r=0.982 4，检出限为0.14 μmol/L(S/N=3)，已远远低于中国饮用水源污染排放标准规定的TNT的最低检出限值0.001 μg/L[10],因此具有较好的实际应用意义。根据金纳米簇荧光强度变化和TNT浓度之间的关系，可以建立一种定量检测TNT的荧光分析方法。

2.4 选择性研究

选择性是衡量分析方法的重要性能指标之一。环境体系复杂且存在多种环境污染物。基于此，选择了环境体系中普遍存在的一些共存污染物，如硝基苯、苯酚、萘酚、苯胺等考察了该荧光探针的选择性，c(共存污染物)=30.0 μmol/L、c(TNT)=6.0 μmol/L，见图9。

图9 2-AP/BSA-Au NCs选择性实验

由图9可知，2-AP/BSA-Au NCs与TNT作用后荧光变化较为显著，而与其他污染物作用后荧光变化很小，结果表明该荧光探针对缺电子的TNT具有较好的选择性。

3 结 论

采用了环境友好的2-AP作为功能分子，通过EDC/NHS交联的方法将2-AP修饰于BSA-Au NCs表面，合成了一种双信号的金纳米簇荧光探针。由于TNT强烈的缺电子性，与富电子的嘌呤环和金纳米簇通过电子转移作用使金纳米簇的荧光猝灭，基于此发展了缺电子-富电子相互作用的荧光传感器设计的新方法，实现了对典型环境污染物TNT的双信号荧光检测，检出限可达0.14 μmol/L。结果表明，相对于其他硝基芳烃和一些共存的环境污染物，TNT对2-AP/BSA-Au NCs双信号荧光探针的信号具有较明显的猝灭作用，具有良好的选择性。此外，该荧光探针的合成设计简单，不存在二次环境污染和光漂白现象。这不仅解决了传统的荧光材料在传感器设计方面的缺陷，也为荧光法检测TNT提供了一种新策略，有望发展成为灵敏、快速的环境污染物的荧光检测方法。