陈春兰，张运君，许和平，郑少颜

（海南省人民医院全科医学科，海南海口570100）

血管瘤是婴幼儿最常见的血管源性皮肤肿瘤，具有迅速增殖后自发消退的特性［1］。大多数血管瘤是良性的，不对婴儿构成严重威胁或产生并发症，但是，少量血管瘤的高速生长或侵袭，可导致组织或器官损伤，并在某些情况下威胁生命［2］。目前，血管瘤的发病机制尚未完全清楚，但血管瘤内皮细胞的非控性增生是引发血管瘤的重要因素［3］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖与血管新生等作用，被认为与血管瘤有着重要的联系［4-5］。藁本内酯（ligustilide）又名3-丁烯基-4，5-二氢-1（3H）-异苯并呋喃酮，是我国传统中药伞形科植物当归挥发油的主要活性成分。研究显示，藁本内酯在舒张血管、抗血小板凝聚、抗炎等方面有生物学活性作用，同时藁本内酯对乳腺癌、肺癌等肿瘤具有抑制作用［6-8］。虽然尚未见到藁本内酯作用于血管瘤的研究及机制的报道，但可根据上述研究预测藁本内酯对其可能具有抑制作用。本研究旨在探讨藁本内酯对人血管瘤内皮细胞（human hemangioendothelial cells，HemECs）增殖与血管新生的影响，并分析其机制。

材料和方法

1 材料和试剂

HemECs 购自上海泽叶生物公司。用EGM-2MV培养基培养于37℃、5% CO2的培养箱中，隔天换液，细胞融合率达到85%时进行传代培养。藁本内酯购自成都曼思特生物科技有限公司；EGM-2MV培养基购自Lonza；Matrigel 购自BD；EdU 细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博公司；TRIzol 试剂盒购自Invitro‑gen；逆转录试剂盒购自Promega；CCK-8 试剂盒和RIPA 细胞裂解液购自上海碧云天生物研究所；抗VEGF、E-cadherin、vimentin 和 β-catenin 抗体及辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗购自Abcam；Lipfectamine 2000转染试剂盒购自Thermo Fisher。

2 仪器

酶标仪购自Thermo Fisher；荧光显微镜购自Nikon；电泳仪及半干转膜仪均购自Bio-Rad；实时荧光定量PCR仪购自ABI。

3 实验方法

3.1 CCK-8 实验 按CCK-8 试剂盒说明书进行操作，于96 孔板中，每孔接种5×103个细胞，每组3 个复孔，培养24 h；将12个浓度梯度（0、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、200、300 和400 µmol/L）的藁本内酯，分别加入对应的12 组孔中，37℃孵育24 h；每孔加入10µL的CCK-8试剂，37℃孵育1 h；酶标仪检测每孔450 nm 波长处的吸光度，并计算细胞相对活力。实验重复3次。

3.2 EdU 染色实验 按照细胞增殖检测试剂盒说明书进行操作，于24 孔板中每孔接种3×104个细胞，培养 24 h；加入 0、10、25 和 50 µmol/L 的藁本内酯处理细胞；再经过血清剥夺，培养48 h；加入20µmol/L EdU 工作液，孵育2 h；加入4%多聚甲醛，并固定15 min；加入200 µL click 反应液避光孵育30 min；使用Hoechst 33342染料进行细胞核染色；荧光显微镜，镜下观察；使用ImageJ 软件计算EdU 阳性细胞；实验重复3次。

3.3 微管形成实验 提前用不同浓度（0、10、25、50µmol/L）的藁本内酯处理HemECs细胞；将Matrigel与4℃预冷的无血清EGM-2MV 培养基按1：1 比例混合后平铺于24 孔板的孔底，每孔300µL，孵育30 min；取先前处理的细胞1.2×108/L 后接种于上述在铺好胶的 24 孔板中，每孔 1 mL，孵育 16 h，每隔 4 h 观察微管样结构形成情况，光学显微镜下随机取5 个视野拍照；采用Microvision Saisam 软件分析图像，并对微管样结构进行计数，实验重复3次。

3.4 Western blot 检测VEGF 及上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关标志物的表达 用0、10、25和50µmol/L浓度的藁本内酯处理 HemECs 于 6 孔板中培养 48 h；使用 RIPA 裂解液将先前处理的细胞进行裂解，提取总蛋白；使用BCA试剂盒检测总蛋白浓度；10% SDS-PAGE 分离蛋白后，用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜；用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白1 h，随后加入Ⅰ抗（VEGF、E-cad‑herin、vimentin和β-catenin抗体稀释度均为1∶1 000），4℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（稀释度为1∶1 000），室温孵育2 h；按照同样的方法与β-actin抗体孵育；ECL化学发光试剂显色。

3.5 镜下观察细胞形态的变化 用不同浓度（0、10、25 和 50 µmol/L）的藁本内酯处理 HemECs 于6 孔板中培养48 h；光学显微镜下随机取5 个视野拍照；取对数生长期的细胞于倒置显微镜下培养，观察各组细胞形态。

3.6 转染实验 按照转染试剂盒说明书进行，转染前，细胞以每孔5×105个接种于6孔板中，待细胞达到80%～90%融合时准备转染，设立未转染组（无特殊处理）、空载体组（转染pcDNA3.1 载体）和VEGF 转染组（转染pcDNA3.1-VEGF165 质粒）。采用Lip‑fectamine 2000 转染，4 h 后更换正常培养液进行培养，48 h后进行相关检测。

3.7 RT-qPCR实验检测VEGF的mRNA表达 按照TRIzol 试剂盒说明书提取总RNA；根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，于PCR仪中进行扩增。反应条件为：95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 10 s，40 个循环。以β-actin 为内参照。VEGF 上游引物序列为5'-AT‑GAACTTTCTGCTGTCTTGG-3'，下游引物序列为5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3'；β-actin 上游引物序列为5'-ATCTGGCACCACACCTTCTA-3'，下游引物序列为5'-CTTCTTAATGTCACGCACGA-3'。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0对所有实验数据进行统计分析，采用单因素方差分析，并用SNK-q检验进行组间两两比较。实验结果以均数±标准差（mean±SD）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CCK-8 实验检测不同浓度藁本内酯对HemECs活力的影响

CCK-8 实验结果表明，与对照组相比，100～400µmol/L 藁本内酯处理组的细胞活力显著降低（P＜0.05），而 0.1～50 µmol/L 的藁本内酯处理对细胞活力的影响并不明显，故选择藁本内酯对HemECs 无显著毒性的浓度（10、25 和50 µmol/L）进行后续的研究，见图1。

Figure 1.The effect of ligustilide at different concentrations on the viability of HemECs.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0µmol/L group.图1 不同浓度的藁本内酯对HemECs活力的影响

2 EdU染色检测藁本内酯对HemECs增殖的影响

EdU 染色结果表明，与对照组相比，25 和50µmol/L 藁本内酯处理组的EdU 阳性（红色荧光）细胞显著减少（P＜0.05），即增殖的细胞显著减少，见图2。

Figure 2.The effect of ligustilide on the proliferation of HemECs detected by EdU staining（×200）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0µmol/L group.图2 EdU染色检测藁本内酯对HemECs增殖的影响

3 微管形成实验检测藁本内酯对HemECs 血管新生的影响

微管形成实验结果可见，对照组中的微管样结构完整而典型，25 和50 µmol/L 藁本内酯处理组的微管样结构被破坏，断断续续、不完整，典型的微管样结构显著减少；通过计数，25 和50µmol/L 藁本内酯处理组相较于对照组的微管样结构数量显著减少（P＜0.05），见图3。

4 Western blot 检测藁本内酯对HemECs中VEGF蛋白表达水平的影响

与对照组相比，25和50µmol/L 藁本内酯处理组VEGF蛋白表达显著下降（P＜0.05），见图4。

5 显微镜下观察藁本内酯对HemECs 上皮-间充质形态转换的影响

显微镜下观察细胞形态显示，对照组细胞呈梭形，细胞间连接松散；与对照组相比，25和50µmol/L藁本内酯处理组的细胞呈椭圆形，细胞密集，细胞间隙小，见图5。

Figure 3.The effect of ligustilide on angiogenesis of HemECs detected by microtubule formation experiment（×100）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0µmol/L group.图3 微管形成实验检测藁本内酯对HemECs血管新生的影响

Figure 4.The effect of ligustilide on the protein expression of VEGF in HemECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs 0µmol/L group.图4 藁本内酯对HemECs VEGF蛋白表达水平的影响

Figure 5.The effect of ligustilide on the morphological changes of epithelial-mesenchymal transition in HemECs was observed under microscope（×100）.图5 显微镜观察藁本内酯对HemECs上皮-间充质形态转换的影响

6 Western blot 检测藁本内酯对HemECs 中EMT标志蛋白表达的影响

Western blot 实验结果显示，与对照组相比，25和50µmol/L 藁本内酯处理组的E-cadherin 蛋白表达水平显著上调（P＜0.05），vimentin 蛋白和β-catenin蛋白表达显著下调（P＜0.05），见图6。

7 蒿本内酯对VEGF 过表达引起的血管新生和EMT的影响

RT-qPCR 实验结果显示，与对照组（未转染组）相比，VEGF 组的mRNA 表达量上调（P＜0.05），见图7A，说明VEGF 过表达成功。Western blot 实验结果显示，与对照组相比，VEGF 组的VEGF 蛋白表达显著上调（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表白显著下调（P＜0.05），vimentin 蛋白表达显著上调（P＜0.05）；与VEGF组相比，ligustilide+VEGF 组的VEGF蛋白表达显著下调（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表达显著上调（P＜0.05），vimentin 蛋白表达显著下调（P＜0.05），见图7B。

讨 论

Figure 6.The effect of ligustilide on the expression of epithelial-mesenchymal transition marker proteins in HemECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs 0µmol/L group.图6 Western blot检测藁本内酯对HemECs中上皮-间充质转化标志蛋白表达的影响

血管瘤是一种常见的婴幼儿良性肿瘤，具有独特的演变周期，包括增生期与消退期。大多数血管瘤未经治疗可自行消退，但是少数血管瘤会干扰视力、呼吸，甚至导致组织或器官损伤，并在某些情况下威胁生命。虽然发病机制尚不清楚，但与血管瘤内皮细胞异常增生密切相关。藁本内酯是苯酞类化合物的典型代表，具有抑制脂质过氧化、改善微循环和抑制肿瘤细胞增殖等作用［9］，其中藁本内酯的抗肿瘤作用越来越受到关注。

研究表明，血管瘤内皮细胞异常增生，病理特征表现为局部杂乱无章的血管过度增生及异常增生的内皮细胞。在血管瘤的治疗方法中，抑制血管瘤内皮增生是一个重要的途径，血管瘤的治疗药物普萘洛尔可以通过抑制血管瘤内皮胞的增生，并促进其凋亡，达到治疗的目的［10］。EdU 染色实验结果中，25和50 µmol/L 藁本内酯处理组的EdU 阳性细胞显著少于对照组，说明藁本内酯能够抑制血管瘤内皮细胞的增殖。

Figure 7.The effect of ligustilide（50 µmol/L）on VEGF overexpression-induced angiogenesis and epithelial-mesenchymal transition in HemECs.A：the mRNA level of VEGF was detected by RT-qPCR；B：the protein levels of VEGF，E-cadherin and vi‑mentin were detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs VEGF group.图7 蒿本内酯对VEGF过表达引起的血管新生和上皮-间充质转化的影响

肿瘤血管生成是指肿瘤细胞诱导毛细血管新生，为肿瘤的生长提供必要的物质基础。在微管形成实验的结果中，与对照组相比，25 和 50 µmol/L 藁本内酯处理组微管样结构的数量显著减少，说明藁本内酯抑制肿瘤细胞的血管新生。肿瘤血管形成是一个复杂过程，受多种因子调节，是刺激因素和抑制因素失衡的结果。VEGF 是目前所知的诱导血管生成最重要的生长因子，也是血管瘤治疗中的重要靶点［11-13］，雷帕霉素治疗血管瘤就是通过降低VEGF 水平，达到治疗的目的［14］。25和50 µmol/L 藁本内酯处理组与对照组相比，VEGF 蛋白表达显著下降，说明藁松内酯可以下调血管瘤内皮细胞的VEGF 的表达，同时提示藁本内酯与VEGF 之间可能存在靶向关系。

EMT 是具有极性的上皮细胞转换为具有活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程［15-16］。而血管瘤恶性化主要表现是血管瘤的高速生长或侵袭。在EMT 的过程中，上皮细胞特征标志物E-cad‑herin［17］表达下调，间充质细胞标志物vimentin［18］和βcatenin［19］蛋白表达上调。通过 Western blot 检测，与对照组相比，25 和50 µmol/L 藁本内酯处理组的E-cadherin 蛋白表达水平显著上调，vimentin 和βcatenin 蛋白表达显著下调，表明藁本内酯具有抑制HemECs EMT的作用。

EMT 是一个由多种途径共同调控的过程，已有研究表明 VEGF 与 EMT 过程密切相关［20-21］。本研究通过构建过表达VEGF的质粒发现，VEGF能够引起HemECs 的 E-caderin 蛋白表达下调和 vimentin 表达上调，促进EMT；而藁本内酯则能阻断VEGF 过表达引起的EMT。

综上所述，藁本内酯能够抑制HemECs 的增殖，并通过降低VEGF 水平抑制HemECs 的血管新生及EMT过程。