林洪鑫，袁展汽，肖运萍，汪瑞清，吕丰娟，张志华

（江西省农业科学院土壤肥料与资源环境研究所/农业农村部长江中下游作物生理生态与耕作重点实验室，江西 南昌 330200）

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯属热带作物，是世界三大薯类作物之一。木薯生育期长（＞8 个月），植株高大（＞2 m），种植行距宽（＞1 m），适宜在其行间间作一季短生育期作物［1］。花生是江西重要的油料作物之一，2017 年面积16.25 万hm2。木薯间作花生是生产中应用较为广泛的一种间作模式。前人对木薯-花生合理间作开展了较多的研究。研究表明，木薯-花生间作能够发挥间作优势［2］，提高土地利用率［3］，提高木薯叶片碳氮代谢酶活性［4］，促进木薯叶片碳水化合物和蛋白质积累与运转［5］，增加木薯根际土壤微生物数量、多样性和土壤养分含量［5］。作物间作对作物根际微生物群落结构存在影响。有研究表明，间作大豆改变甘蔗根际土壤细菌、固氮细菌群落结构和多样性［6］；间作紫云英能够减少油菜根际土壤微生物量，改变微生物群落结构和抑制厌氧细菌生长［7］。间作明显增加了土壤细菌、真菌、放线菌和固氮菌数量［8］，显著增加了甘蔗根际土壤真菌和放线菌数量［9］，能够提高作物根际细菌群落多样性和改变群落结构组成［10］；施用充足的氮磷钾肥，能够丰富土壤固氮菌多样性［11］。然而，前人应用PCR 技术［10-13］或常规方法［5］对土壤微生物数量、群落结构和多样性的研究较多，仅局限于可培养微生物和环境优势菌群。基于16S r RNA基因的高通量测序技术，通过非培养方法对环境中微生物群落进行研究，可更真实地反映环境中微生物群落的复杂性和多样性，并对不可培养微生物和痕量菌进行深入分析［14-15］。本研究以木薯单作为对照，采用高通量测序技术，在单位面积等量施肥条件下研究了施氮和间作花生对木薯根际土壤细菌群落结构的影响，以期为木薯-花生合理间作和减量施肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2017 年在江西省抚州市东乡区圩上桥镇国家木薯产业技术体系南昌综合试验站试验基地（N 28°11′26″，E 116°30′17″）进行。试验地为红壤旱地，试验前基础土壤理化性质为pH 值5.00，有机质17.71 g·kg-1、全氮1.29 g·kg-1、全磷0.96 g·kg-1、全钾9.80 g·kg-1、碱解氮100.2 mg·kg-1、有效磷67.61 mg·kg-1和速效钾136.3 mg·kg-1。

1.2 试验设计

以木薯品种“华南205”和花生品种“粤油200”为试验材料，设计不施氮（N0）、施氮（N1，180 kg·hm-2）2 个处理和单位面积等量施肥条件下的3 种种植模式，即木薯单作（M1）、花生单作（M2）及木薯间作花生（M3）。3 种种植模式的种植行距示意图见图1。施磷（P2O5）量和施钾（K2O）量分别为90.0、195.0 kg·hm-2。随机区组排列，小区种植面积为38.4 m2，3 次重复，小区间隔60 cm，小区间开30 cm 排水沟，重复间隔150 cm，防止串肥。3 种种植模式的施肥量及施肥方式见表1。磷肥全部作基肥施用。氮、磷、钾肥分别为尿素、钙镁磷肥和氯化钾。木薯于2017年3 月27 日种植，11 月27 日收获，花生于4 月13 日播种，8 月17 日收获。其他管理同一般常规栽培。

表1 3 种种植模式的施肥量及施肥方式

图1 3 种种植模式的行距示意图

1.3 木薯根际土壤收集

于花生收获前1 d（块根膨大期），每小区选择生长一致的植株5 株，先用小铲子弄松根部周围的土壤，然后轻轻将植株拔起，轻轻抖落根部的土壤，用已经消毒的羊毛刷刷下附着在块根根际的土壤。待5 株根际土壤混匀，将其中一部分装入10 mL 离心管并迅速放入装有干冰的泡沫箱内，带回实验室后进行过筛（2 mm）处理，并放入超低温冰箱-80℃保存，用于测定土壤细菌的多样性；剩余部分土壤装入自封袋，待土壤自然风干，研磨后过筛，用于测定土壤理化性质。

1.4 土壤DNA 扩增和高通量测序

采 用E.Z.N.A.土壤DNA 试剂盒（Omega，美国），按其说明书提取土壤细菌，对0.5 g 鲜土样品进行DNA 扩增。细菌扩增区间为16S rDNA 的V3～V4区，引物序列为：338F（5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-G GACTACH VGGGTWTCTAAT-3’）［16-17］。

参照文献［18］和上海美吉生物医药科技有限公司的标准（上海，中国）进行高通量测序。所有的原始数据已经存入NCBI 序列读取存档（SRA）数据库（登记号：SRP104351）。

1.5 测序数据处理

来自于Illumina MiSeq 测序平台的序列通过使用QIIME（版本1.70）软件包进行处理［19］。应用FLASH 软件进行数据去杂。OTU 是人为给某一个分类单元设置的统一标志。OTU 聚类生成OTU 表格。为了得到每个OTU 对应的物种分类信息，采用RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，并分别在域（domain），界（kingdom），门（phylum），纲（class），目（order），科（family），属（genus）和种（species）等分类水平，比对Silva 16S rRNA 数据库。随机抽取不同样品的序列，对所有处理序列进行归一化处理，得到相同数量的序列（23056）。细菌多样性采用OTU 实际观察数量（Sobs）、辛普森指数（Simpson）、ACE 指数、Chao 指数和香农指数（Shannon）。并使用加权的UniFrac 距离法进行主坐标分析［20］。UniFrac 距离法是一种基于加权距离分子方差分析，它利用Mothur 软件（版本1.29）［21］进行评估样本之间的显著性差异。

1.6 土壤理化性质

pH 值用梅特勒-托利多FE-20 pH 计测定；有机质用重铬酸钾容量法测定；全氮采用半微量凯氏法测定；全磷采用氢氧化钠熔融、钼锑抗比色法测定；全钾采用氢氧化钠熔融、火焰光度法测定；碱解氮用1.0 mol·L-1NaOH 碱解扩散法测定；速效钾用1.0 mol·L-1NH4OAc-火焰光度法测定；有效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定。

1.7 木薯和花生生物产量

于块根成熟期，每小区选择生长一致，具有代表性植株5 株，考察植株鲜生物产量。于荚果成熟期，每小区取代表性花生植株3 株，考察单株植株干重。

1.8 木薯和花生产量

每小区称量实收、成熟期取样的块根鲜重，然后根据成熟期实际株数折算，即为鲜薯产量。每小区称量实收、成熟期取样的花生荚果干重，根据小区面积计算花生荚果产量。土地当量比（LER）=（Yim/Ymm）+（Yip/Ymp）。式中，Yim和Yip分别代表间作木薯和间作花生的产量，Ymm和Ymp分别为单作木薯和单作花生的产量。

1.9 统计分析

通过使用DPS 7.05 统计软件的双因素Dancan新复极差法对细菌群落多样性和组成、产量进行方差分析（P＜0.05）。图片采用Excel 2003 和Adobe Illustrator Artwork 15.0 软件绘制。不同处理的细菌群落差异采用阿多尼斯功能（Adonis function）中的布雷柯蒂斯相异（Bray-Curtis dissimilarities）的Perm ANOVA 分析。不同处理间有显著差异的物种采用STAMP（2.1.3）软件进行Wilcoxon 秩和检验。

2 结果与分析

2.1 施氮和间作对木薯、花生产量的影响

同一种植模式下，施氮处理的鲜薯产量、生物产量显著高于不施氮处理（表2）。花生单作模式（M2）下，施氮处理的荚果产量和生物产量较不施氮处理提高，而花生间作模式下，施氮处理的生物产量较不施氮处理下降，荚果产量显著下降。在等量施肥条件下，不论是施氮处理，还是不施氮处理，木薯间作花生的土地当量比均大于1，具有间作优势。施氮条件下的间作优势低于不施氮。

表2 不同处理的木薯和花生产量

2.2 木薯根际土壤细菌α 多样性

丰富度指数包括Chao 和ACE，多样性指数包括辛普森和香农。同一施氮水平下（表3），间作木薯Sobs（OTU 实际观察数量）、香农、ACE 和Chao 高于单作木薯，而辛普森低于单作木薯，差异不显著。同一种植模式下，不施氮处理Sobs、香农、ACE 和Chao 高于施氮处理，而辛普森低于施氮处理，但差异不显著。不同施氮水平和种植模式组合间，N0M3处理样品中Sobs 最高，为1 793，N1M1处理的样品Sobs 最低，为1 491。N0M3处理的Sobs、ACE 和Chao 显著高于N1M1处理。

表3 木薯根际土壤细菌的序列数和细菌α 多样性

2.3 细菌群落门类水平组成

木薯根际土壤细菌4 个主要门类依次为Chloroflexi、Proteobacteria、Actinobacteria 和Acidobacteria，相对丰度分别为35.23%～49.04%、14.38% ～ 21.59%、10.78% ～ 18.59% 和10.55% ～13.93%， 合 计 比 例 占 总 比 例 的84.92%～88.13%，是优势菌群。分析结果（图2）表明，不同处理组合间细菌门类Saccharibacteria 的差异极显著，而其他14 个细菌门类无显著差异。

不同施氮处理间（图3a），施氮处理Verrucomicrobia 的相对丰度显著低于不施氮处理，降幅为55.13%；unclassified k norank 的相对丰度显著高于不施氮处理，增幅为69.70%；变形菌门和放线菌门的相对丰度高于不施氮处理，增幅分别为10.14%和25.33%；绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度低于不施氮处理，降幅分别为9.07%和10.54%。不同种植模式间（图3b），间作模式变形菌门和放线菌门的相对丰度高于单作模式，增幅分别为9.62%和7.76%；绿弯菌门的相对丰度低于单作模式，降幅为9.70%；酸杆菌门的变化较小，M1和M3分别为12.24%和12.20%。

2.4 细菌群落属类水平组成

木薯根际土壤细菌的属数量共464 个，以排名前30 的菌属作为纵坐标，分析比较不同处理组合间的菌属差异。分析结果（图4）表明，不同处理间根际土壤菌属Acidobacteriaceae__Subgroup_1_（P＜0.05）、Sphingomonas（P＜0.05）、norank（Saccharibacteria）（P＜0.01）的差异达显著或极显著水平。

图2 不同处理的细菌群落组成比较图

不同施氮处理间（图5a），施氮处理Acidothermus（热酸菌属）和norank 的相对丰度显著高于不施氮处理，增幅分别为113.53%和84.85%；而施氮处理的Subgroup_7显著低于不施氮处理，降幅为46.49%。不同种植模式间（图5b），间作木薯JG37-AG-4、B12-WMSP1和Acidobacteriaceae__Subgroup_1_的相对丰度低于单作木薯，降幅分别为24.21%、10.35%和14.12%。

2.5 主坐标分析

应用基于加权UniFrac 的主坐标分析比较木薯根际土壤细菌属水平的群落组成（图6）。UniFrac distances 的PCoA 分析表明，第一主成分（PC1）为43.25%，第二主成分（PC2）为23.76%。施氮对细菌群落组成的影响大于种植模式。N0M1分布于第一象限，N0M3分布于第二、四象限，说明不施氮条件下，单作木薯与间作木薯的细菌群落组成存在差异；N1M1分布于第三、四象限，N1M3分布于第一、三、四象限，说明施氮条件下，单作木薯与间作木薯的细菌群落组成差异减小。单作模式中，不施氮与施氮的细菌群落组成存在差异；间作模式中，不施氮与施氮的细菌群落组成也同样存在差异。

图3 不同处理的门水平细菌群落组成比较图

图4 不同处理的细菌属类比较图（Top 30）

图5 不同处理的细菌属类比较图（Top 30）

图6 不同处理的细菌属水平主坐标分析

2.6 根际土壤理化性质与菌群组成的关系

土壤理化性质与细菌群落结构关系密切。冗余分析（RAD）（图7）表明，有机质、pH 值显著影响细菌属水平群落组成（r2=0.732 0**、0.543 2*）。环境因子对属水平菌群组成影响顺序大小为有机质、pH 值、全氮、速效钾、全磷、全钾、碱解氮和有效磷。有机质与pH 值和全磷呈负相关，而与全氮、全钾、速效钾、碱解氮和有效磷呈正相关。

图7 不同处理的细菌属水平冗余分析

3 讨论

土壤微生物能够调节自身群落结构的多样性和组成，在调节土壤肥力方面发挥着重要作用［22-23］。根系互作对改善土壤微生态环境、增加土壤微生物数量和酶活性以及提高作物产量具有重要意义［24］。本研究中，在等量施肥条件下，木薯-花生间作模式增加了系统中作物的生物产量和果实产量，间作模式的土地当量比均大于1，都表现出明显间作优势，且不施氮条件下的间作优势高于施氮条件。有研究表明，间作玉米能够提高甘蔗根际土壤微生物的活性［25］，间作大豆可以显著增加甘蔗根际土壤真菌和放线菌数量［9］，甘蔗-黄瓜轮套作提高了黄瓜根际土壤细菌种群的多样性指数和均匀度指数［26］。徐海强等［12］认为，间作花生改变了木薯根际土壤细菌的群落结构，但对其多样性影响不明显。本研究表明，木薯-花生间作对木薯根际土壤细菌的α 多样性无显著影响，间作略高于单作。也就是说，木薯-花生间作提高了木薯根际土壤细菌的多样性。这与徐海强等［12］的研究结果一致。本研究还表明，间作花生提高了木薯根际土壤细菌变形菌门和放线菌门的相对丰度，降低了木薯绿弯菌门的相对丰度，也降低了菌属JG37-AG-4、B12-WMSP1和Acidobacteriaceae__Subgroup_1__的相对丰度。可见，木薯-花生表现出间作优势可能与木薯根际细菌群落结构的变化有一定的关系。木薯和花生的共生期为4 个月，在共生期内两作物间存在竞争和互补关系，而在花生之后，则有利于木薯块根膨大。周岚等［27］研究证实，随着施氮水平的提高，连作和轮作模式土壤中细菌群落多样性和丰富度呈减少趋势。有研究表明，氮磷钾合理配施可增加土壤细菌的丰富度和多样性［28］，长期有机无机配施可显著提高土壤细菌多样性和改变其群落结构［29］。也有研究表明，施肥对土壤细菌群落α 多样性指数的影响不显著［30］。本研究表明，施氮对木薯根际土壤细菌的多样性无显著影响，施氮处理略低于不施氮处理。这个结果与杨亚东等［30］和Fierer 等［31］报道的结果一致。然而，Li 等［32］认为施氮能够丰富土壤细菌的多样性，这可能与作物种类、土壤类型和取样时期等不同有关。本研究还表明，施氮显著降低疣微菌门的相对丰度，显著提高了热酸菌属的相对丰度，而显著降低了菌属Subgroup_7的相对丰度。杨亚东等［30］认为，土壤含水量和pH 值是造成土壤细菌数量、多样性和群落结构差异的主要原因。Jones 等［33］认为pH 值是对Acidobacteria 群落组成影响最重要的环境因子，而Acidobacteria 在世界范围内所有土壤中都是优势菌群之一。酸杆菌门的相对丰度是随着施氮量的增加而增加，这可能与增加施氮量降低了土壤pH 值等有关［34］。本研究冗余分析表明，有机质、pH 值显著影响木薯根际土壤细菌属水平群落组成（r2=0.732 0**、0.543 2*）。环境因子中，有机质、pH 值对属水平菌群组成影响大于全磷、碱解氮、全氮、速效钾、全钾和有效磷。本试验只研究分析了花生收获期木薯根际土壤细菌的多样性和群落结构，而没有分析作物共生期内、花生收获之后木薯根际土壤的细菌群落结构，相关内容需进一步研究。