APP下载

浅谈固相合成类多肽原料药的工艺控制

2020-09-02王华

中外医学导报·下半月 2020年2期
关键词:多肽原料药

王华

【摘要】固相化学合成法是合成类多肽原料药的重要手段之一,目前主要采用Fmoc方法进行合成。在工艺研究过程中,氨基酸缩合、树脂肽裂解、转型、反相制备纯化和冷冻干燥等步骤,对原料药质量均有不同程度的影响。本文论述了在制备工艺的不同步骤,对原料药质量的影响因素以及相应的控制策略,从而达到工艺稳定可控,生产出优质原料药。

【关键词】固相合成法;多肽;原料药;工艺控制;

【中图分类号】TQ464.7 【文献标识码】A 【文章编号】2096-7225(2020)04-0013-01

1引言

随着现代科技的不断进步,医药研发领域取得了很大程度的突破。多肽类药物作为医药的一个细分领域,生物活性广泛。尽管多肽药物问世时间较短,但是发展速度很快,近年来越来越多的多肽类新药获批上市。固相合成具有合成效率高和纯度高的优势,更容易实现自动化和工业化,在医药行业中被广泛应用。

2固相合成原理

多肽固相合成法由Merrifield 开创,被授予了诺贝尔化学奖。固相合成法是选用合适的固相载体,将氨基酸逐个连接到载体上,最后将合成的多肽链从载体上释放出来的一种新型合成方法。合成过程通常是从C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固体相载体结合,然后这一氨基酸的氨基与第二个氨基酸羧基反应,重复 (缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一氨基酸缩合)步骤,连接成为长肽链[1]。最后将肽链从树脂中分离出来,再经过制备纯化等工艺,即获得所需目标产物。

3工艺控制

固相合成法克服了液相合成法中,每一步产物都需后处理的困难。在中间体监控方面相对较弱。需要研发人员对生产工艺的深入研究,降低粗肽中杂质含量。以下从氨基酸缩合、树脂肽裂解、转型、制备纯化和冷冻干燥步骤进行阐述。

3.1氨基酸缩合

在氨基酸缩合过程中,监控缩合反应为茚三酮显色法,此法灵敏度较高。此步骤容易产生消旋转化的异构体杂质,缩合及脱Fmoc不完全形成的缺失肽杂质,以及反应试剂活性过高或反应条件剧烈形式的插入肽杂质。

常见易消旋化氨基酸有Cys、His和Phe,通常在缩合试剂中加入HOBT抑制其消旋,也可以降低反应温度、使用高效缩合试剂、提高物料比等措施,进一步降低其消旋程度,控制异构体杂质。

缺失肽类杂质引入有三个途径:①缩合反应不完全:可以通过提高物料比、高效缩合试剂和提高温度等方式进行控制;同时需关注茚三酮显色的假阳性现象。②脱Fmoc反应不完全:可以通过多次反应或提高哌啶浓度等方式进行控制。③困难位点:肽序列中含有Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln和Thr等氨基酸,相互比邻或重复时,肽链舒展性不好,合成效率下降[2]。可以改变溶剂体系和降低树脂取代率来改善其缩合效果。

插入肽类杂质在易缩合位点更容易产生,可以通过降低反应条件,如反应温度,碱性试剂用量(DIC,DIEA等),避免缩合反应过程中Fmoc脱落后继续反应产生插入肽。

3.2树脂肽裂解

按照肽序列进行氨基酸缩合后得到树脂肽,需要将其与载体树脂分割得到目标肽。一般采用TFA切割,切割过程中加入乙二硫醇,苯甲硫醚,水,三异丙基硅烷,苯酚等。主要作为碳正离子俘获试剂,俘获切割反应过程中生成的碳正离子,减少其对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应。

此步骤容易产生氨基酸侧链保护基脱落不完全(如Pbf、tBu等)、肽键断裂、非天然氨基酸修饰侧链的断裂,含-SH肽的氧化/聚合等杂质,此步骤产生的杂质较多,也比较复杂。通常从裂解配方、反应浓度、裂解温度、裂解时间等方面进行研究和控制,降低其后续制备纯化步骤中难以清除的杂质。

3.3 转型

多肽原料药大多为醋酸盐形式,树脂肽采用含三氟乙酸配方进行裂解,所得粗肽中一般含约15%的三氟乙酸,需要對其进行转盐处理。目前主要方法有反相C18填料转型、离子交换树脂和化学方法除酸等,其中C18填料转型的除去效果最好,但此方法操作繁琐,成本较高。离子交换树脂和化学方法可除去粗肽中大部分三氟乙酸,含量降低至1%左右。同时后续制备纯化步骤也具有一定的除酸效果,从而进行控制。结合工艺简繁程度和成本,目前这两种方法更受研究者的青睐。

3.4 制备纯化

在多肽原料药工艺中,制备纯化步骤是工艺中除杂最为关键的步骤。工艺中产生的相关杂质,均在此步骤中进行有效去除,从而达到原料药纯度要求。多肽序列的性质决定了纯化条件,一般根据酸碱性选择填料类型,根据溶解性选择流动相组成,根据极性大小选择梯度条件,同时也相互影响。

在纯化主要条件确定后,进一步考察上样量、溶样体系、流动相PH、制备柱清洗等影响因素,结合纯度和收率等指标,确定纯化工艺。此步骤一般不会引入新杂质,仍需关注纯化液在浓缩和贮存条件下的稳定性情况,避免在后处理过程中杂质含量增加。

3.5冷冻干燥

多肽类原料药大多采用冷冻干燥方式获得成品,冻干步骤一般在有关物质方面较为稳定,主要与原料药的一些化检指标(如醋酸含量、水分、溶液澄清度等)相关。冻干的影响因素有批量差异、冻干液体积、样品浓度、冻干液面高度和冻干液溶剂组成,以及冻干程序和设备稳定性[3]。工艺开发前期确定其关键影响因素,在中试放大阶段进一步考察确定,从而达到稳定可控的生产工艺。

综上所述,由于多肽药物对某些疾病具有独特的治疗效果,在过去几十年里,多肽的应用在生物化学家和医务人员手中得到了越来越多的关注。多肽合成的出现和发展,促进着医药领域的进步。多肽固相合成目前主要用于中短肽链的合成,从氨基酸缩合至冷冻干燥的工艺步骤中,每个步骤均有诸多的影响因素,需要进行深入全面的工艺研究,从而开发出稳定可控,优质的原料药。对于固相合成中氨基酸缩合反应监测的弱点,需寻找更合适的监测手段,促进多肽固相合成技术的发展。

参考文献:

[1]黄蓓. 多肽固相合成研究进展[J].河南化工.2018,30(1): 28-30.

[2]韩香,王德心. 多肽合成中“困难序列”的缩合研究进展[J].药学学报.2007.42(2):111-117.

[3]蔡继兰.药品冻干过程中各关键环节的控制及常见问题分析[J]. 药学研究.2013.32(3).179-182.

猜你喜欢

多肽原料药
奥氮平原料药纯化及质量控制分析
国家反垄断局成立后“第一刀”为何砍向原料药?
圣诺生物:研发优势显著、实现全产业链布局的专业多肽药物生产企业
中晟全肽:为全球研发“救命良药”加速
印度库存中国原料药告急
印度与中国争夺原料药市场
核酸适配体在多肽研究中的应用
浅谈生物多肽的临床作用
发改委:规范短缺药原料药
多肽固相合成的研究进展