柴晓玲 郝雅茹 王佳蕊 李书国

（河北科技大学生物科学与工程学院 石家庄050018）

阪崎肠杆菌是一种周生鞭毛、能运动、无芽胞的革兰氏阴性菌，也是一种条件致病菌，能够引起严重的新生儿脑膜炎、 坏死性小肠结肠炎和菌血症，并可能存在严重的神经系统后遗症，在新生儿中的致死率可达50%～80%[1-2]。国际食品微生物标准委员会 （International Committee on Microbiological Standards for Food，ICMSF）将其列为“严重危害特定人群生命， 引起长期慢性实质性后遗症”的一种致病菌[3]。 将阪崎肠杆菌放置并对其危险性进行评估，与最初相比发现：温度25 ℃，放置6 h，阪崎肠杆菌的相对危险性增加30 倍；放置10 h，增加30 000 倍[4]。 其广泛存在于环境和食品中，科学家从多种食物和饮料中分离出阪崎肠杆菌，并发现土壤、水、下水道、动物和人类排泄物以及植物的根和径等处都有阪崎肠杆菌[5-7]。此外，有报道临床也是其来源之一[8-11]。

目前， 阪崎肠杆菌的检测方法有传统检验方法、分子生物学法、电化学免疫传感器法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检验法、 金标快速诊断法以及免疫学检测方法[12-24]。传统的检测方法存在操作繁琐、耗时长以及不易分辨结果等缺点。分子生物学检测技术的不断完善和发展， 克服了传统检测方法存在的问题， 为食源性病原微生物的检测提供了一种快速、灵敏、特异的方法，可作为一种可靠的检测方法。 电化学免疫传感器检测阪崎肠杆菌具有操作简单、响应快速、灵敏度高、不受样品颜色和浊度影响等优点，在食品、医学和环境等领域有很多研究和初步的应用。 张晓等[25]通过将硫堇（Thi）和辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体依次自组装固定于多壁碳纳米管（MWCNT）/十二烷基苯磺酸钠（SDBS）修饰的四通道丝网印刷电极上，制成一次性免疫传感器，该方法检测阪崎肠杆菌的线性范围为102～108mL-1，检测限为5.7×101CFU/mL。

以玻碳电极为基础电极， 以聚酰胺胺树枝状大分子材料结合还原性石墨烯纳米复合物为电活性修饰膜层，固定于玻碳电极表面，采用物理吸附法或牛血清白蛋白-戊二醛交联方法固定化辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体制备纳米传感器，建立免疫传感器技术，用于快速测定婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的残留量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、氯化钾（分析纯）、过氧化氢（分析纯），天津博迪化工股份有限公司；聚酰胺胺树脂，无锡市阿尔兹化工有限公司；石墨烯，北京德科岛金。

1.2 仪器与设备

LK98Bп 型微型电化学分析系统，天津兰力科化学电子高技术有限公司；三电极系统、电解杯，上海CHI 仪器公司；KQ2200 型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；HH-4 型恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 电极的预处理 将玻碳电极 （Glassy carbon electrode，GCE）用Al2O3抛光粉抛光打磨至镜面后先用蒸馏水清洗干净， 再依次用二次去离子水、 无水乙醇以及二次去离子水超声清洗3～5 min，最后用氮气吹干。 在pH 7.0 的磷酸盐缓冲液中加入铁氰化钾、氯化钾和过氧化氢，使其浓度分别为2，0.1 mol/L 和0.5 mmol/L，得到电解质溶液。将玻碳电极、Ag/AgCl 参比电极和铂丝（片）对电极插入电解质溶液中， 采用循环伏安法 （电位：-0.2～+0.6 V；扫描速度：50 mV/s）扫描处理，持续扫描直至循环伏安图稳定， 取出玻碳电极用二次蒸馏水清洗干净，氮气吹干，备用。

1.3.2 石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备 将一定量的石墨烯粉末加到二次蒸馏水中， 使其质量浓度为0.5 mg/mL， 搅拌1～2 min， 超声处理15～20 min，得到均匀一致的黑色石墨烯悬浮液，备用。

将2.0 代聚酰胺-胺溶于1%的乙酸溶液中，使聚酰胺-胺的质量浓度为1.0×10-3g/mL，在室温条件下， 磁力搅拌55～60 min， 得到聚酰胺-胺溶液。将聚酰胺-胺溶液和石墨烯悬浮液按体积比1∶1 混合均匀，超声处理1.5～2 h，得到均匀稳定的石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液。

1.3.3 免疫传感器的制备 准确量取5 μL 石墨烯-聚酰胺-胺纳米复合物溶液滴涂到洗净的玻碳电极表面， 于室温下自然晾干或用便携式红外干燥器烘干。在玻碳电极表面滴涂5 μL 的辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体， 置于4 ℃冰箱内反应1.5 h。 滴涂5 μL 1%牛血清白蛋白溶液于37 ℃处理60 min 封闭非特异性吸附位点。 将修饰后的电极取出， 用二次去离子水冲洗去除未结合的多余辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体，得到阪崎肠杆菌纳米免疫传感器， 于4 ℃避光条件下保存备用。

1.3.4 电化学检验方法 电化学试验采用三电极体系： 免疫电极为工作电极，Ag/AgCl 电极为参比电极，铂丝（片）电极为对电极，采用循环伏安法对免疫传感器电化学表征。 用循环伏安法检测阪崎肠杆菌， 测试底液为含2 mmol/L 铁氰化钾，0.1 mol/L 氯化钾和0.5 mmol/L 过氧化氢的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）。 用生理盐水制备各浓度梯度的阪崎肠杆菌菌悬液，在每个电极上滴加3～8 μL 菌悬液，于室温孵育20 min，用双蒸水冲洗干净，晾干。 通过差分脉冲伏安法检测免疫传感器还原峰电流值来检测样品中的阪崎肠杆菌。

1.3.5 免疫传感器法测定样品中阪崎肠杆菌 取100 g 检测已有阪崎肠杆菌的奶粉样品加入已预热至（45±1）℃装有900 mL 灭菌水的锥形瓶中，缓缓摇动至样品充分溶解，（36±1）℃培养18～22 h。移取1 mL 转种于10 mL 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤中，（36±1）℃培养18～22 h。 取1 mL 培养液备用。

采用1.3.4 节三电极测试系统，在电解质溶液中进行电化学测试。 用差分脉冲伏安法进行扫描处理，扫描速度50 mV/s，电压范围-0.2～+0.6 V。取出免疫传感器， 用二次去离子水冲洗去除电极表面的电解质，备用。

在纳米免疫传感器上滴涂5 μL 备用的培养液，室温孵育20 min，再次进行电化学测试。

1.3.6 实时荧光PCR 法测定 反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共计40 个循环。

以细菌16Sr DNA 和23Sr DNA 保守序列为通用引物对6 株阪崎肠杆菌区间序列扩增、 测序并设计引物。 提取培养菌DNA，采用荧光PCR 扩增。 确定反应条件，得出溶解曲线，建立一种高特异性、高灵敏度、简捷快速的荧光染料PCR 检测方法， 并将实际样品的检测结果与纳米免疫传感器法的结果对比。

1.3.7 纳米免疫传感器法与国标法检验阪崎肠杆菌的对比 收集30 份不同批次的奶粉，用纳米免疫传感器法和国标法分别检测其阪崎肠杆菌，讨论纳米免疫传感器法在检验结果上是否可行。

2 结果与分析

2.1 电极修饰过程的循环伏安表征

采用循环伏安法研究不同电极对电极电化学特征的影响，结果如图1 所示。

由图1 可知，a 电极（玻碳电极）在电解质溶液中出现1 对可逆的氧化-还原峰， 当修饰电极后，氧化-还原峰电流值增大，这是因为修饰物加强了电子传递能力。而加入抗体后氧化-还原峰电流值降低， 说明酶标抗体成功地包埋在修饰物复合膜中。免疫反应后，氧化-还原峰电流值大幅降低，说明电极表面上抗原-抗体免疫反应后生成的免疫复合物在空间上阻碍了媒介体和底物的扩散，电子传递受阻所致。

2.2 优化的试验条件

2.2.1 测试底液中过氧化氢浓度 在底液中加入不同浓度的过氧化氢，分别为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mmol/L，其它底液成分同样，观察免疫电极的还原峰电流值。

如图2 所示， 过氧化氢浓度小于0.5 mmol/L时，免疫电极还原峰电流值逐渐变大，随着过氧化氢浓度的增大， 免疫电极还原峰电流值虽然在增大，但是增幅变小。 考虑到检测的灵敏度、酶催化的活性以及高浓度的过氧化氢可能损坏辣根过氧化物酶活性， 底液中过氧化氢的浓度以0.5 mmol/L 为最佳浓度。

图1 不同电极在测试底液中的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammogram of different electrodes in the base solution

2.2.2 测试底液中pH 值 测试底液的pH 值过高或过低都会影响酶标抗体的活性， 从而影响抗原与抗体的结合。 固定除pH 值外的所有条件，不同pH 条件下循环伏安法测试还原峰电流值的响应结果如图3 所示。 当pH 7.0 时，免疫电极信号最强。 最终选择测试底液的pH 值为7.0。

图2 测试底液过氧化氢浓度与免疫电极还原峰电流的关系Fig.2 The relationship between the concentration of hydrogen peroxide in the base solution and the peak current of the immunoreduction electrode

2.2.3 孵育时间 孵育时间和温度是影响免疫反应的重要因素。 图4 显示，随着孵育时间的增加，免疫响应电流值增大，孵育时间超过20 min，免疫电极还原峰电流值的增幅变小，几乎不再增长。考虑到免疫反应效率， 试验中选择孵育时间为20 min。 考虑到抗体的活性，选择（37±1）℃为最佳孵育温度。

2.3 免疫电极对不同浓度阪崎肠杆菌悬液的差分脉冲检测结果

采用循环伏安法检测免疫前、 后还原峰的电流值。 由图5 可知，阪崎肠杆菌的含量在102～108CFU/mL 之间变化时，免疫前、后的电流值变化与阪崎肠杆菌浓度的对数呈良好的线性关系， 线性方程为ΔIpc（μA）=1.1817 lgC-1.723，相关系数为0.9989，检出限为5.8×101CFU/mL（S/N=3）。

2.4 样品中阪崎肠杆菌的检验结果

由图6 可知，a 以Ag/AgCl 电极为参比电极，铂丝（片）为对电极，免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统， 在电解质溶液中进行电化学测试。 用差分脉冲伏安法扫描处理，扫描速度为50 mV/s， 电压范围-0.2～+0.6 V， 得到差分脉冲伏安图。 b 以涂有阪崎肠杆菌抗原的免疫传感器为工作电极的三电极测试系统得到的差分脉冲伏安图。 将a 与b 重叠后得到图6。 结果表明，与a 相比，b 的响应电流值明显变小，说明抗原与抗体结合，也就是说，奶粉中有阪崎肠杆菌被检测出来。

图3 底液pH 值与免疫还原峰电流值的关系Fig.3 The relationship between pH value of base solution and the reduction peak current

图4 孵育时间与免疫还原峰电流值的关系Fig.4 Relationship between incubation time and the reduction peak current

图5 免疫电流还原峰电流值与阪崎肠杆菌浓度对数的差分脉冲伏安图Fig.5 Differential pulse voltammetry between the peak and the logarithm of Enterobacter sakazakii concentration

图6 样品中阪崎肠杆菌的脉冲伏安图Fig.6 Pulse voltammograms of Enterobacter sakazakii in samples

2.5 实际样品检测结果与国标检测结果的比较

为了验证此方法在实际操作中的可行性，采用免疫传感器法检测30 个未知样品。 分析此数据，从30 个样品中均没有检出阪崎肠杆菌。 同时，采用国标方法检测30 个样品，检测结果与免疫传感器法结果一致。 为了证明此方法可行，对其中两个样品按标准添加阪崎肠杆菌，然后做检测，检测结果为阳性，符合率达到100%。 证明此方法可行。

表1 国标方法和免疫电极法检测奶粉样品Table 1 Determination of milk powder samples by national standard method and immunoelectrode methods

2.6 纳米免疫传感器法检验阪崎肠杆菌的方案

2.6.1 样品的增菌 按照1.3.5 节方法增菌。

2.6.2 纳米免疫传感器法检测 按照1.3 节方法进行电极的预处理、 石墨烯-聚酰胺-胺复合物的制备以及免疫传感器的制备。

2.6.3 电化学检测 对免疫传感器滴涂3～8 μL备用的培养液，室温孵育20 min。 以Ag/AgCl 电极为参比电极，铂丝（片）为对电极，阪崎肠杆菌免疫传感器为工作电极，组成三电极测试系统，在电解质溶液中进行电化学测试。 用差分脉冲伏安法扫描处理，扫描速度50 mV/s，电压范围-0.2 ～+0.6 V。

2.6.4 结果 被测样本免疫前、 后传感器的还原峰电流的变化值几乎为0 时，未检出阪崎肠杆菌。被测样本免疫前、 后传感器的还原峰电流的变化值ΔI 大于等于0.36 μA 时，阪崎肠杆菌筛选呈阳性。 若ΔI 在0～0.36 μA 之间，需重复1 次，结果仍是ΔI 在0～0.36 μA 之间， 说明阪崎肠杆菌未检出。

3 结论

阪崎肠杆菌作为一种食源性致病菌， 可引起多种病状。 基于阪崎肠杆菌与抗体的免疫电化学响应， 提出以聚酰胺树脂和石墨烯溶液修饰玻碳电极并加上辣根过氧化物酶标记的阪崎肠杆菌抗体为检测阪崎肠杆菌工作电极的电化学检测方法，构建了一种速度快、灵敏度高、稳定性强的纳米免疫传感器， 并应用于实际婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的检测。 采用微分脉冲法测定婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌，并对其检测条件进行优化，最佳条件为： 底液中过氧化氢浓度为0.5 mmol/L，pH 7.0 的PBS 溶液作为检测底液， 孵育时间为20 min。采用微分脉冲伏安法确定阪崎肠杆菌的免疫响应电流与其浓度之间的线性关系， 确定其线性方程为ΔIpc（μA）=1.1817 lgC-1.723，相关系数为0.9989，其最低检测限达到5.8×101CFU/mL（S/N=3）。 此方法检测奶粉中阪崎肠杆菌的结果与国标方法的结果一致， 说明此方法用于奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测是可行的，具有简便、快速及准确的特点，在食品安全检测方面具有应用价值。

Rapid Determination of Enterobacter sakazakii in Infant Formula Powders by Nano-immunosensor Based on Dendrimer-PAMAM