谢丽施，张 宁，李长玲，黄翔鹄

硝酸钠对波吉卵囊藻生长、生化组分及沉降的影响

谢丽施，张 宁，李长玲，黄翔鹄

（广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518000；广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；广东省藻类养殖及应用工程技术研究中心，广东 湛江 524025）

研究硝酸钠对波吉卵囊藻（）生长、生化组分及沉降的影响。采用分光光度计法、乙醇法、尼罗红染色法、苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法，分别测定波吉卵囊藻在不同硝酸钠浓度下的生物量、叶绿素、脂质、总糖和蛋白质含量，分析波吉卵囊藻沉降与生长及生化组分的关系。1）硝酸钠对波吉卵囊藻沉降率有显著影响（< 0.05），当硝酸钠74.8 mg/L时，沉降6 h的沉降率达到75%，沉降效果最佳。2）硝酸钠对波吉卵囊藻生物量和叶绿素的影响显著（< 0.05），培养9 d时，硝酸钠37.4 ~ 748.0 mg/L组卵囊藻生物量和叶绿素含量较高，生长状态好，沉降率较高；经回归分析，沉降率与生物量呈正相关关系（2= 0.824 3），与叶绿素含量呈先增加后减少的抛物线关系(2= 0.819 8)。3）硝酸钠对波吉卵囊藻脂质和总糖含量的影响显著（< 0.05），硝酸钠质量浓度为37.4 ~ 2 992.0 mg/L时，总糖和脂质含量少，沉降率较高；经一元回归分析，沉降率与脂质和总糖含量呈负相关关系，2分别为0.770 5和0.609 4。4）沉降率与生物量和叶绿素有显著正相关性，皮尔逊系数分别为0.785和0.404；与脂质和总糖有显著负相关性，皮尔逊系数分别为―0.788和―0.731。硝酸钠通过影响波吉卵囊藻的生长和生化组分来改变藻细胞的沉降率；波吉卵囊藻的沉降率与生长状态呈正相关关系，与脂质、总糖呈负相关关系，脂质和总糖含量越少，沉降效果越好，与蛋白质无显著相关关系。

波吉卵囊藻；硝酸钠；生化组分；沉降

微藻生态制剂是可即时使用的具有特定生态学功能的活性微藻产品，可通过大规模化培养微藻、浓缩活体微藻来生产。在虾池中使用微藻生态制剂可定向培育池塘藻相，稳定藻相，改变养殖水质，提高对虾养殖成功率，减少化学药物使用，保证养殖产品质量。目前，微藻生态制剂开发利用面临微藻活体浓缩效率低、成本高等问题。由于微藻个体微小，培养密度小，细胞易损伤破裂，大部分藻细胞因表面带负电荷而均匀悬浮在水体中，难以自然沉降，因此，微藻采收成本高昂。研究表明，大规模培养过程中微藻采收成本约占微藻生产总成本的20% ~ 30%，甚至高达50%[1-3]，极大限制了微藻的应用。微藻采收方法中，离心、过滤易造成藻细胞机械损伤，无法保证浓缩后藻细胞活性，且这些方法耗能大，成本高；如添加外源絮凝剂，则存在絮凝剂回收成本和对微藻下游工艺安全性问题[4-7]。因此，沉降法采收微藻虽效率低、耗时长，却是最绿色经济的方法，可保证浓缩后藻细胞活性。

微藻细胞大小、形状，特性，生长状况等内部因素，光照、温度、盐度、营养盐等外部条件均影响微藻沉降[8]，进而影响沉降采收效率。水体营养盐浓度可改变藻细胞的组分和密度，进而影响浮游微藻下沉率[9-11]。微藻可产生黏性代谢物质，使其形成群体，从而增加沉降率[12-14]。波吉卵囊藻（）是一种可自沉降浓缩的绿藻，其自沉降特性对藻类活体浓缩有重要意义，但其自沉降机理尚未见报道。笔者研究不同硝酸钠浓度对波吉卵囊藻生化组分含量及沉降变化的影响，为波吉卵囊藻的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种来源

实验用波吉卵囊藻藻种取自广东海洋大学水产学院藻类资源开发与养殖环境生态修复实验室，取指数生长期波吉卵囊藻用于实验。

1.2 卵囊藻的培养

将指数生长期波吉卵囊藻接种于无氮源人工海水[15]配制的灭菌f/2培养基[16-17]，饥饿处理48 h。

预实验中发现10倍硝酸钠浓度梯度对波吉卵囊藻生长、生化组分和沉降率均无显著影响，故用高氮浓度梯度（20/40/70倍），即以硝酸钠为唯一氮源，将离心洗涤后的藻液接种于含0、37.4、74.8、149.6、748.0、1 496.0、2 992.0、5 236.0 mg/L硝酸钠的f/2培养基中，使藻液初始接种量藻细胞数为42.70万~ 44.43万个/mL。实验在含1 000 mL f/2培养基的烧杯中进行，每组设3个平行组，于光照培养箱中培养9 d。培养温度为（25±1）℃，各组盐度调为30，照度为2 000 lx，光暗周期为12L：12D，pH值7.9 ~ 8.0，每天定时搅拌4次。

1.3 分析方法

1.3.1 沉降率测定 培养9 d后对波吉卵囊藻沉降率进行测定。将藻液重悬均匀后，在液面下3 cm处，分别在重悬后0.5、1、2、3、6、9、12 h等时间点取3 mL藻液，测定其在680 nm处的光密度值(680 nm)。

沉降率计算公式[18]：

沉降率=[(680nm)-(680nm)0]/(680 nm)0。

其中，(680nm)0和(680nm)分别为初始时和沉降时上清的680 nm处光密度值。

1.3.2 波吉卵囊藻生物量测定及生长分析 参考文献[19]进行。每天定时取藻液3 mL，用UV2450紫外分光光度计测定680 nm处的光密度值(680nm)，以藻液光密度值表征卵囊藻生物量。波吉卵囊藻细胞数（，万个）与(680nm)（）的标准曲线：

= 0.002 3+ 0.021 8，2= 0.999 7。

以相对生长常数表征藻细胞生长速率。相对生长常数计算公式[20]：

= lg[(680nm)-(680nm)] / (1-0)。

1.3.3 叶绿素含量的测定 采用乙醇法测定培养0、4、9 d时的藻体叶绿素含量。取藻液5 mL，用0.22 μm的混合纤维滤膜过滤，将载有波吉卵囊藻的混合纤维滤膜置于离心管中于-20℃下冷冻12 h以上。向离心管中加入5 mL 80 ℃预热的体积分数95%的乙醇，于80 ℃下水浴5 min后，摇匀。常温下黑暗处静置处理24 h，以5 000 r/min离心10 min，取上清液3 mL，用UV2450紫外分光光度计测定其在665、649 nm处的光密度值[21]。

光合色素含量（mg/L）计算公式：

叶绿素a质量浓度 = 13.95(665nm)- 6.88(649 nm)；

叶绿素b质量浓度 = 24.96(649nm)- 7.32(665 nm)；

叶绿素总质量浓度= [6.63(665nm) + 18.08(649 nm)] ×t×/q。

式中，t为提取液体积（L），为提取液稀释倍数，q为样品体积（L）。

1.3.4 脂质的测定 用尼罗红染色法[22]测定培养9 d后藻细胞的脂质含量。取浓缩藻液用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至(680nm)为0.8；取藻液1 mL，以7 800 r/min离心4 ~ 5 min，去除上清液；加入1 mL 1×PBS洗涤藻细胞，吹打均匀，以7 800 r/min离心5 min，去除上清液，用1 mL体积分数2%的二甲基亚砜水溶液（DMSO）重悬藻细胞，使藻液(680nm)为0.8，于38 ℃下水浴18 min，按1 mL藻液加20 μL尼罗红染料（质量浓度为0.1 mg/mL丙酮溶液）比例，混匀，染色5 min，取250 μL于酶标板中，用酶标仪测定脂质在激发波长480 nm、散发波长570 nm下的荧光强度，以荧光强度表征脂质含量。

1.3.5 总糖的测定 用苯酚硫酸法[19,23]测定培养9 d的藻细胞总糖含量。取藻液30 mL，以8 000 r/min离心10 min，弃上清；在藻泥中加入10 mL 12.2 g/L的NaOH溶液，震荡均匀，于58.5 ℃下水浴60 min，以8 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 mL，用双蒸水稀释至2.0 mL，取稀释液200 μL，快速加入200 μL体积分数5%苯酚、1 000 μL体积分数98%硫酸，室温下静置10 min，摇匀，避光静置20 min后，取250 μL于酶标板中，用EnSpire酶标仪测定490 nm处的光密度值；根据标准曲线计算样品中总糖质量浓度。

葡萄糖含量标准曲线：

= 0.005 4+ 0.260 3，2= 0.998 7。

其中，为光密度，为葡萄糖质量浓度(μg/mL)。

1.3.6 蛋白质的测定 用考马斯亮蓝法测定培养9 d后藻细胞蛋白质含量[24-25]。取藻液30 mL，以8 000 r/min离心10 min，弃上清。在藻泥中加入10 mL 12.2 g/L的NaOH溶液，震荡均匀，于58.5 ℃下水浴60 min，以8 000 r/min离心5 min，取0.5 mL上清液，补1×PBS至2.0 mL；取100 μL上清液，加入1 000 μL 1×G250染色液，室温放置5 min。取250 μL于酶标板中，用酶标仪测定595 nm处光密度值，根据标准曲线计算出样品中蛋白质量浓度。

蛋白质含量标准曲线：

= 0.002 6+ 0.723 1，2= 0.983 8。

其中，为光密度，为蛋白质质量浓度(μg/mL)。

1.4 数据统计分析

用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行单因素方差分析和Duncan多重比较，0.05或0.01。用SPSS 19.0软件对沉降率和各组分进行皮尔森系数相关性分析。用GraphPad Prism7.0软件进行作图。

2 结果

2.1 硝酸钠浓度对波吉卵囊藻沉降率的影响

因各组在沉降6 h时已有显著差异，之后沉降趋势相同，所以选择6 h时的沉降率数据进行分析。图1可见，硝酸钠对波吉卵囊藻沉降率影响显著（< 0.05），硝酸钠质量浓度在37.4 ~ 2 992.0 mg/L时沉降率分别为70%、75%、72%、72%、72%、70%，极显著高于0 mg/L和5 236.0 mg/L时（< 0.01）。74.8 mg/L组自然沉降6 h沉降率可达75%，在氮限制条件下，波吉卵囊藻沉降率下降，为54%。

凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05）

2.2 硝酸钠浓度对波吉卵囊藻生长的影响及其生物量与沉降率的相关性

图2、3可见，不同浓度硝酸钠对波吉卵囊藻相对生长常数影响显著（< 0.05），表明不同浓度硝酸钠对波吉卵囊藻生长影响显著。质量浓度为37.4 ~ 149 6 mg/L硝酸钠实验组的相对生长常数显著高于0 mg/L和5 236.0 mg/L组（< 0.05）（图2）。培养9 d时，各组生物量见图3，随硝酸钠浓度增加波吉卵囊藻的生物量增加；当硝酸钠质量浓度大于1 496.0 mg/L时，其生物量下降，对波吉卵囊藻生长有限制作用。37.4 ~ 748.0 mg/L硝酸钠组生物量极显著高于其他组（< 0.01），其中，37.4 mg/L组(680 nm)为0.515（图3）。经一元回归分析，沉降率与生物量呈显著正相关关系（图4），生物量积累越多，沉降速度越快。沉降率与生物量的线性方程：= 127.82+ 7.265 5，2= 0.824 3。

凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05）

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图4 生物量与6 h沉降率之间的相关性

2.3 硝酸钠浓度对波吉卵囊藻叶绿素含量的影响及其与沉降率的相关性

图5可见，不同浓度硝酸钠对波吉卵囊藻叶绿素含量的影响显著（< 0.05），培养9 d时，随着硝酸钠浓度增加，波吉卵囊藻叶绿素含量增加；硝酸钠质量浓度在37.4 ~ 5 236.0 mg/L范围内的叶绿素含量显著高于无氮组（0 mg/L）（< 0.05），其中，2 992.0 mg/L组单细胞叶绿素含量最高达1401.5 pg。经回归分析，沉降6 h时沉降率与叶绿素含量存在先增后减的抛物线关系（图6）。6 h沉降率与叶绿素含量的线性方程如下：= -0.000 062+ 0.115 5+ 16.926，2= 0.819 8。

凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05）

图6 叶绿素与6 h沉降率之间的相关性

2.4 硝酸钠浓度对波吉卵囊藻脂质含量的影响及其与沉降率的相关性

图7可见，不同浓度硝酸钠对波吉卵囊藻脂质含量的影响显著（< 0.05）。在培养基中加入硝酸钠后，卵囊藻脂质含量随着硝酸钠浓度的升高而升高。培养9 d时，硝酸钠质量浓度在37.4 ~ 149.6 mg/L范围内，脂质含量显著低于0 mg/L、2 992.0 mg/L和5 236.0 mg/L处理组。波吉卵囊藻在缺氮0 mg/L和高氮胁迫5 236.0 mg/L时，脂质含量显著高于其他组，表明胁迫条件有利于波吉卵囊藻积累脂质。一元回归分析表明，沉降率与脂质含量之间呈负相关关系（图8），脂质含量越少，沉降速度越快。沉降率与脂质含量的线性方程：= - 0.002 3+ 93.885，2= 0.770 5。

凡含一个相同字母者表示差异不显著（P > 0.05）

图8 脂质与6 h沉降率之间的相关性

2.5 硝酸钠浓度对波吉卵囊藻总糖含量的影响及其与沉降率的相关性

图9可见，不同浓度硝酸钠对波吉卵囊藻总糖含量影响显著（< 0.05）。9 d时，37.4 ~ 149.6 mg/L硝酸钠组总糖含量极显著低于0mg/L组（<0.01）。748.0 ~ 2 992.0 mg/L硝酸钠组总糖含量显著低于5 236.0 mg/L组（< 0.05），极显著低于0 mg/L组（< 0.01）。0 mg/L硝酸钠浓度组单细胞总糖含量最高，为16.693 pg。一元回归分析表明，沉降率与总糖含量之间呈负相关关系（图10），总糖含量越少，沉降速度越快。沉降率与总糖含量的线性方程：= -2.821 6+ 102.72，2= 0.609 4。

2.6 硝酸钠浓度对波吉卵囊藻的蛋白质含量的影响及其与沉降率的相关性

不同硝酸钠浓度对波吉卵囊藻蛋白质含量有显著性影响（< 0.05）（图11）。培养9 d时，随硝酸钠浓度增加卵囊藻的蛋白质含量增加；当硝酸钠质量浓度增加到2 992.0 ~ 5 236.0 mg/L后，蛋白质含量显著高于其他组，单细胞蛋白质含量为16.584、12.978 ng。一元回归分析表明，沉降率与蛋白质含量没有发现显著线性关系。

凡含一个相同字母者表示差异不显著（> 0.05）

The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level

图9 不同硝酸钠浓度培养末期波吉卵囊藻的总糖含量

Fig. 9 Contents of total sugar ofat the end of culture with different concentrations of sodium nitrate

图10 总糖与6 h沉降率之间的相关性

凡含一个相同字母者表示差异不显著（> 0.05）

The data with a same letter mean no significant difference at 0.05 level

图11 不同硝酸钠浓度培养末期波吉卵囊藻的蛋白质含量

Fig. 11 Contents of protein ofat the end of culture with different concentrations of sodium nitrate

2.7 波吉卵囊藻沉降率与生长及细胞组分的相关性

沉降率与波吉卵囊藻的生物量、叶绿素、脂质、总糖和蛋白质相关性分析结果如表1所示。总体来说，波吉卵囊藻的沉降与其生长及生化组分有显著的关系（< 0.05 ），皮尔逊系数越接近1或-1，则相关性越显著。由表1可知，沉降率与生物量有极显著正相关性（< 0.01），皮尔逊系数为0.785，与叶绿素有显著正相关性（< 0.05），皮尔逊系数为0.404，沉降率与脂质和总糖有极显著负相关性（< 0.01），皮尔逊系数分别为-0.788和-0.731，而蛋白质与沉降率无相关性。结果表明，卵囊藻生长状态越好，脂质和总糖含量越少的情况下，沉降效果越好。

表1 波吉卵囊藻6 h沉降率与生长及细胞组分的相关性

注：**表示在0.01水平上显著相关；*表示在0.05水平上显著相关

Note: ** means significant correlation at the 0.01 level; * means significant correlation at the 0.05 level.

3 讨论

3.1 生长对沉降率的影响

具有沉降特性的微藻生长状态佳，沉降速度快。许多硅藻有一定的沉降特性[9-10,26]。李晓倩[8]调查发现，海区硅酸盐含量限制微藻生长，降低浮游植物的沉降率。Bienfang和Harrison等[9-10]的研究也发现，氮限制降低了硅藻的沉降率。这些研究表明，在受到外界环境因子的影响（如营养盐限制）时，微藻生长状态不好，因而影响沉降率。本研究表明，硝酸钠浓度在37.4 ~ 748.0 mg/L范围时，波吉卵囊藻生物量和叶绿素含量高，沉降率也高，且生长状态越好，沉降速度越快。微藻具有独特的生物特性，作为自身具有沉降特性的波吉卵囊藻，在生长状况良好的时候，可使沉降速度达到最佳。

3.2 脂质对沉降率的影响

脂质含量会影响微藻的沉降率。Belcher等[27]研究发现，布朗葡萄藻（Kützing）通过积累油脂使细胞上浮。Griffiths等[11]研究发现，镰形纤维藻（）、栅藻（sp.）、扁藻（）、钝顶螺旋藻（）等随着脂肪含量升高，沉降率降低，而富油新绿球藻（）、筒柱藻（）、三角褐指藻（）则随着脂肪含量升高，沉降率升高。由此可见，不同微藻脂质含量影响沉降的效果不同，可能与微藻自身细胞的大小、形状以及独特的生物特性有关。本研究中，波吉卵囊藻在硝酸钠浓度74.8 mg/L时脂质含量显著较低，沉降率最高，6 h即可达到75%，而脂质含量最高的0 mg/L和5 236.0 mg/L实验组6 h的沉降率最低，波吉卵囊藻脂质含量与沉降率呈负相关关系，即脂质越少，沉降率越大。脂质密度较小，脂质的增加导致藻细胞密度减小，可能是沉降变慢的主要原因。

3.3 总糖对沉降率的影响

外部因素会影响微藻多糖含量和种类的变化，韩谦[19]研究发现，波吉卵囊藻（）在不同培养条件下，总糖含量有显著变化，成分也发生改变。微藻多糖会影响微藻的沉降率。郭锁莲[13]和Alam等[14]研究发现，自絮凝栅藻（AS-6-1）细胞壁多糖可使游离小球藻（CNW11）和栅藻（FSP）絮凝沉降。本研究中，波吉卵囊藻在硝酸钠浓度74.8 mg/L时总糖含量显著降低，沉降率最高，沉降6 h即可达到75%，而总糖含量最高的0 mg/L和5 236.0 mg/L组6 h的沉降率最低，波吉卵囊藻的总糖含量与沉降率呈负相关关系，即总糖含量越小，沉降率越大。波吉卵囊藻总糖成分中可能存在某种糖类使其沉降，而在硝酸钠浓度为37.4 ~ 2 992.0 mg/L时，这种糖类含量升高，使沉降加速，具体原因需进一步深入研究，而总糖含量升高导致沉降率下降的原因亦有待进一步研究。

本研究通过改变硝酸钠浓度来改变藻细胞生长状态和细胞组分，达到改变沉降率目的。结果表明，硝酸钠浓度在37.4 ~ 748.0 mg/L范围内，波吉卵囊藻沉降率较高，且生长快，状态好。在大规模培养波吉卵囊藻时，可控制硝酸钠的使用浓度范围在37.4 ~ 748.0 mg/L内，以加快波吉卵囊藻的生长速度和沉降速度，缩短沉降时间，节约规模化培养的成本，最终得到浓缩卵囊藻，制成微藻制剂产品，应用于对虾养殖，提高对虾养殖成功率。所以，将波吉卵囊藻开发成微藻生态制剂，在加速对虾绿色健康养殖方面发挥重要意义。

4 结论

硝酸钠浓度在37.4 ~ 748.0 mg/L范围内，波吉卵囊藻沉降率较高。硝酸钠浓度通过影响波吉卵囊藻的生长和生化组分来改变藻细胞的沉降率，波吉卵囊藻沉降率与生长及生化组分有显著性，其中，相关性最显著的是脂质和生物量。波吉卵囊藻的生长状态和沉降率呈正相关关系，生长越好，沉降率越高。波吉卵囊藻的脂质和总糖与沉降率呈负相关关系，脂质和总糖的含量越少，沉降率越高。波吉卵囊藻的蛋白质与沉降率无显著相关关系。硝酸钠在74.8 mg/L时，卵囊藻生长状态最佳，脂质和总糖含量最少，沉降率显著优于其他浓度组，短时沉降效果最好。

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Effects of Sodium Nitrate on Growth, Biochemical Components and Sedimentation of

XIE Li-shi, ZHANG Ning, LI Chang-ling, HUANG Xiang-hu

（,,518000,;,,524088,;,524025,）

The effects of sodium nitrate on the biochemical components and sedimentation ofwere studied.The biomass, chlorophyll, lipid, total sugar and protein contents ofwere determined by Spectrophotometer method, ethanol method, Nile red method, phenol sulfuric acid method and Bradford method. The relationship between sedimentation, growth and biochemical components ofwas analyzed(1) Sodium nitrate had a significant effect on the sedimentation ratio of(0.05). The 6-hour sedimentation ratio was good and reached 75% when the sodium nitrate was 74.8 mg/L (2) Sodium nitrate had a significant effect onbiomass and chlorophyl (0.05). On the ninth day, when the sodium nitrate concentration was 37.4 – 748.0 mg/L, the biomass and chlorophyll content ofwas high, the growth condition was good, and the sedimentation ratio was high. Through regression analysis, the sedimentation ratio was positively correlated with the biomass, and the correlation coefficient2was 0.824 3. The sedimentation ratio and chlorophyll content showed a parabolic relationship, with the correlation coefficient2= 0.820. (3) The effect of sodium nitrate on the lipid and total sugar content ofwas significant (0.05). When the concentration of sodium nitrate was 37.4 – 2 992.0 mg/L, the total sugar and lipid content was low and the sedimentation ratio was high. Through unitary regression analysis, the sedimentation ratio was negatively correlated with lipid and total sugar content, with2= 0.771 and 0.609 respectively. (4) Pearson correlation analysis showed that the sedimentation ratio had a significant positive correlation with biomass and chlorophyll, and the Pearson coefficient r was 0.785 and 0.404, respectively. The sedimentation ratio had a significant negative correlation with lipids and total sugar, and the Pearson coefficientwere –0.788 and –0.731, respectively.The concentrations of sodium nitrate changes the sedimentation ratio of algal cells by affecting the growth and biochemical components of. The sedimentation ratio and growth state ofwere positively correlated. The sedimentation ratio ofwas negatively correlated with lipid and total sugar content; the lower the lipid and total sugar content, the better the sedimentation effects. There was no significant correlation between sedimentation ratio and protein level.

; sodium nitrate; biochemical components; sedimentation

S917.3

A

1673-9159（2020）03-0048-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.007

2020-01-21

深圳市大鹏新区产业发展专项资金“活性微藻制品产业化关键技术的研究与示范”（KY20180112）；广东海洋大学博士启动项目

谢丽施（1994―），女，硕士研究生，研究方向为水产养殖。E-mail:x-lishi@qq.com

黄翔鹄（1962―），男，教授，主要从事水域生态和养殖环境研究。E-mail:hxh166@126.com

谢丽施，张宁，李长玲，等. 硝酸钠对波吉卵囊藻生长、生化组分及沉降的影响[J]. 广东海洋大学学报，2020，40（3）：48-55.

（责任编辑：刘庆颖）