王 玲，杨心悦，刘 珂，陈明晰，徐新花

(郑州师范学院 化学化工学院，河南 郑州 450044)

瑞香素，又称祖师麻甲素，具有镇痛、抗菌、抗癌、抗炎及抗氧化等作用[1-2]，是中草药祖师麻的活性指标成分。建立灵敏检测瑞香素的方法，不仅可以监控中草药产品质量，而且对于研究其药理活性具有一定的指导价值。目前检测瑞香素的方法主要有液相色谱法和荧光法[3-5]。与以上分析方法相比，电化学传感技术具有仪器价格低廉、操作简便及灵敏度高的优点。目前利用电化学传感器对瑞香素进行检测的方法较少[6-7]，因此，建立一种灵敏度高、选择性强、操作简便的测定瑞香素的电化学传感新方法仍具有重要意义。

石墨烯自2004年被英国物理学家Andre Geim和Konstantin Novoselov发现后,引起科学工作者的密切关注和广泛的研究兴趣，基于石墨烯纳米材料构筑的电化学传感也得到了广泛应用[8]。目前，石墨烯制备仍有需要解决的问题，如完整的石墨烯片层之间存在较强的范德华力，易发生不可逆聚集，导致有效比表面积远低于理论比表面积。在电化学传感器分析中，石墨烯的优异性能只有在单层下才能充分发挥[9]。另外，还原氧化石墨烯中常用的还原剂水合肼属于剧毒性物质。而三维还原氧化石墨烯(3D-rGO)的网状结构有利于阻止石墨烯片层之间的聚集堆叠，不仅具备二维石墨烯的固有特性，而且具有多孔形貌、高吸附性能、高导电性及更强的可塑性等优点[10]。Mohamed等[11]利用腺嘌呤作为功能化试剂，通过冷冻、干燥氧化石墨烯溶液等步骤制备了腺嘌呤功能化的3D海绵状石墨烯，实现了对可待因的灵敏检测。聚苯乙烯磺酸钠(PSS)是一个具有大π共轭结构的高聚物分子，可与石墨烯片层发生π-π相互作用达到抑制石墨烯聚集的目的。

本研究以PSS为功能化试剂，抗坏血酸为还原剂，通过冷冻、干燥、高压反应制备了3D海绵状石墨烯(3D-PSS-rGO)。构建了基于3D-PSS-rGO复合材料修饰电极测定瑞香素的电化学传感，实现了对祖师麻粉中瑞香素的灵敏检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

天然石墨粉(200 mesh，Alfa Aesar)；聚苯乙烯磺酸钠(PSS，阿拉丁试剂有限公司)；瑞香素(98%，上海源叶生物科技有限公司)；抗坏血酸(99%，天津市科密欧化学试剂有限公司)。祖师麻粉(中药材市场)。0.1 mol/L PBS缓冲溶液用0.1 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4(含有0.1 mol/L KCl)配制，并用NaOH或H3PO4调节pH值。其它试剂均为分析纯，使用时未经进一步提纯。实验用水为二次蒸馏水，且所有实验均在室温下进行。

T6紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。FD-1C-50冷冻干燥器(北京博医康实验仪器有限公司)。RST5000电化学工作站(苏州瑞斯特仪器有限公司)，配备传统三电极体系：铂柱为对电极，甘汞为参比电极，玻碳电极(GCE，直径3 mm)或修饰电极为工作电极。pHS-3C型精密pH测定仪(上海雷磁仪器有限公司)。H1650高速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 PSS功能化海绵状石墨烯复合材料(3D-PSS-rGO)的合成

氧化石墨烯(GO)的合成采用改良的Hummer方法[12]。制备的氧化石墨烯依次用5%盐酸和H2O2洗涤至中性，在-53 ℃、10 Pa冷冻干燥得海绵状氧化石墨烯(SGO)。 取50 mg SGO至50 mL H2O中，超声分散均匀后，加入500 mg PSS；继续超声60 min后，加入250 mg抗坏血酸，然后转移至100 mL高压反应釜中，170 ℃反应8 h得黑色悬浮液[11]，反复离心和洗涤3次得3D-PSS-rGO。

1.3 3D-PSS-rGO修饰电极(3D-PSS-rGO/GCE)的制备

玻碳电极用0.03 μm Al2O3抛光打磨后分别在乙醇和水中超声清洗干净。处理好的电极吹干后，将上述制得的10 μL 0.5 mg/mL的3D-PSS-rGO材料滴涂至电极表面，得3D-PSS-rGO/GCE。

1.4 样品预处理

称取1.0 g祖师麻粉，加入20 mL甲醇，超声3 h后倒出提取液，继续将提取液加热浓缩至2 mL，用修饰电极检测提取液中瑞香素成分的含量。重复上述操作，直至提取液不显示瑞香素的电化学响应。将上述所有的提取液收集至离心管中，100 00 rpm离心30 min，吸取上清液至10 mL容量瓶中，甲醇定容，待测。

1.5 测定方法

三电极体系置于含有一定量瑞香素标准溶液的PBS缓冲溶液中，搅拌富集12 min后，在0.1～0.8 V范围内，以100 mV·s-1的速率进行循环伏安扫描，研究瑞香素在电极表面的电化学行为；采用线性扫描伏安法建立标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 3D-PSS-rGO复合材料的表征

图2 GCE在10.0 μmol/L瑞香素(a)，3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(b)和10.0 μmol/L瑞香素(c)中的循环伏安曲线Fig.2 Cyclic voltammograms of GCE in 10.0 μmol/L daphnetin(a),3D-PSS-rGO/GCE in blank solution(b) and 10.0 μmol/L daphnetin(c)

图3 不同扫速下，3D-PSS-rGO/GCE在 10.0 μmol/L瑞香素溶液中的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of 3D-PSS-rGO/GCE in 10.0 μmol/L daphnetin at different scan ratesscan rate(a→j):0.08,0.1,0.12,0.15,0.2,0.25,0.3 V/s

2.2 瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE 上的电化学行为和反应机理

在pH为2.0的PBS缓冲溶液中，考察了GCE 和3D-PSS-rGO/GCE电极对10.0 μmol/L瑞香素响应的循环伏安图，结果如图2所示。从图2可以看出，瑞香素在GCE(图2a)上有弱电化学响应(Ipa=1.1 μA,Ipc=0.24 μA)。3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(图2b)中无明显伏安响应，但在瑞香素溶液(图2c)中，其峰电流强度明显增大(Ipa=118 μA，Ipc=78.1 μA)，且3D-PSS-rGO/GCE的电化学响应信号约为GCE的100倍。3D-PSS-rGO对瑞香素显示优异的电催化活性可能有两方面原因：一是3D-PSS-rGO的良好电子传导性能；二是3D-PSS-rGO的褶皱多孔结构可能对瑞香素有强富集作用，提高了瑞香素在电极表面的吸附量。

为了考察3D-PSS-rGO/GCE电极对瑞香素的吸附富集情况，研究了瑞香素的电极反应机理。图3为不同扫描速率(0.08～0.3 V·s-1)时，3D-PSS-rGO/GCE对瑞香素电化学响应的循环伏安曲线。可观察到，随着扫描速率(v)的增大，氧化峰电位(Epa)正移，还原峰电位(Epc)负移，说明瑞香素在该修饰电极上的动力学反应是准可逆过程。E与lnv的关系为：Epa(V)=0.60+0.022lnv(V·s-1)(r2=0.988 0)，Epc(V)=0.46-0.024lnv(V·s-1)(r2=0.991 2)。根据Laviron[17]理论:

(1)

(2)

图4 3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(a)和在200.0 μmol/L瑞香素溶液(b)中的计时电量图Fig.4 Chronocoulometric response curves obtained at 3D-PSS-rGO/GCE in blank(a) and 200.0 μmol/L daphnetin solution(b)insert:relationship of charge Q vs.t1/2

式中，α为电子转移系数，n为电子转移数，F为法拉第常数，R为8.314 J/(mol·K),T为298 K。计算得到电子转移数n≈2。

进一步考察了电流强度与扫描速率的关系。发现在0.08～0.3 V/s范围内，Ipa及Ipc均随着扫描速率的增大而逐渐增加：Ipa(μA)=519.7v(V·s-1)+60.3(r2=0.982 6)，Ipc(μA)=394.2v(V·s-1)+25.3(r2=0.986 2)；同时，Ipa(μA)=436.4v1/2(V·s-1)-26.9(r2=997 8)，Ipc(μA)=326.4v1/2(V·s-1)-38.9(r2=0.973 3)。表明I与v及v1/2均呈线性关系，判断瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上是由吸附和扩散共同控制的电极反应过程[18-19]。

对于吸附和扩散共同控制的电极反应过程，可采用计时电量法获得瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE表面的饱和吸附量。首先作出3D-PSS-rGO/GCE在含1.0 mmol/L K3Fe(CN)6和0.1 mol/L KCl溶液中的计时电量曲线。根据Anson公式[20]求得3D-PSS-rGO/GCE的有效电极面积为0.14 cm2，同样条件下求得GCE的有效电极面积为0.065 cm2。以上数据表明3D-PSS-rGO的加入增大了电极有效面积，有利于吸附富集更多的被测物分子，从而为提高检测灵敏度提供了可能。图4为3D-PSS-rGO/GCE在空白溶液(曲线a)和瑞香素溶液(曲线b)中的计时电量曲线(Q-t)。以Q对t1/2作图，对应结果如图4插图，回归方程分别为：Q(C)=8.98×10-5+2.60×10-5t1/2(r2=0.997 0，斜线a)，Q(C)=2.77×10-4+5.54 ×10-5t1/2(r2=0.998 2，斜线b)。其中，斜线b的斜率为a的2倍，进一步证实了瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的电极反应是由吸附和扩散共同控制的过程[18-19]。

根据Anson[20]饱和吸附量公式：

(3)

Qdl为双电层电量；Qads为吸附的瑞香素产生的法拉第电量，即Q-t1/2关系中a、b两斜线的截距差(Qads=1.87×10-4C)；n为电子转移数，F为法拉第常数，A为电极面积，c为被测物浓度，D为扩散系数，t为时间。再根据Laviron吸附公式Q=nFAΓ*，计算出瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的饱和吸附量(Γ*)为6.9×10-9mol/cm2。同样实验条件下，瑞香素在裸电极上的饱和吸附量为1.8×10-10mol/cm2。以上数据表明3D-PSS-rGO对瑞香素具有较强吸附富集能力，从而可产生更强的电化学响应信号。

2.3 实验条件的优化

图5 不同pH时，10.0 μmol/L瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的循环伏安图Fig.5 Cyclic voltammograms of 3D-PSS-rGO/GCE in10.0 μmol/L daphnetin at different pH values

2.3.1 介质酸度的选择介质酸度是影响电极反应的重要因素之一。从图5可以看出，当支持电解质的pH值从1.0逐渐增至8.0时，瑞香素的氧化还原峰电位均逐渐负向移动，说明质子参与了瑞香素的电极反应过程。氧化还原峰电位与pH关系为：Epa(V)=0.69-0.058 pH(r2=0.977 5)，Epc(V)=0.62-0.062 pH(r2=0.996 5)。关系曲线的斜率与理论值0.059 V·pH-1接近，表明瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的电极反应过程中质子数与电子数相等，即为2电子2质子的电极反应过程。此外，当pH值在1.0～3.0范围时，瑞香素的氧化还原峰电流较大且较稳定，此后，电流强度随着pH值的增大逐渐降低。这是由于pH值较大，且大于瑞香素pKa时，瑞香素主要以阴离子形式存在，与负电性3D-PSS-rGO材料之间存在静电斥力，抑制了瑞香素在电极表面的吸附富集，因此峰电流较小。反之，瑞香素与修饰材料之间静电吸引作用有利于增大瑞香素在修饰电极表面的吸附量，提高测定灵敏度。因此，实验选择pH 2.0作为测定瑞香素的最佳酸度值。

图6 不同浓度瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE上的LSV响应曲线Fig.6 LSV curves of different concentrations daphnetin at 3D-PSS-rGO/GCEcdaphnetin(a→k):0.08,0.4,0.6,0.8,1.0,4.0,8.0,10.0,20.0,40.0,60.0 μmol/L;insert:the calibration curve of I vs.c

2.3.2 富集时间的选择对于吸附参与的电极反应过程，预富集有利于提高测定的灵敏度。实验考察了富集时间对瑞香素在3D-PSS-rGO/GCE修饰电极表面电化学响应的影响。结果显示，随着富集时间的增加，电流强度逐渐增大，10 min后趋于平稳，表明此时瑞香素在电极表面已吸附饱和。实验最终选择12 min作为最佳富集时间。

2.4 标准曲线

在优化实验条件下，利用线性扫描伏安法(LSV)研究了瑞香素氧化峰电流与浓度之间的关系。由图6可以看出，随着瑞香素溶液浓度增大，氧化峰电流逐渐增大。在0.08～10.0 μmol/L和10.0～60.0 μmol/L范围内，峰电流与浓度呈良好线性关系，回归方程分别为Ipa(μA)=12.53c(μmol·L-1)+2.900(r2=0.997 7)，Ipa(μA)=1.300c(μmol·L-1)+119.6(r2=0.985 5)，检出限为0.04 μmol/L。该方法的灵敏度与已报道的电化学分析方法相当[6-7]，但该方法具有制备过程简单、稳定性好、线性范围宽的优点。

2.5 重现性与选择性

同样方法分别构筑了5支修饰电极，研究了它们对50.0 μmol/L瑞香素溶液的响应情况，其峰电流响应值的相对标准偏差(RSD)为5.4%，表明该修饰电极具有较好的重现性。

2.6 实际样品的分析

为了检验所构筑方法的适用性，利用3D-PSS-rGO/GCE测定祖师麻粉中瑞香素的含量。祖师麻粉样品的前处理方法参照“1.4”。取0.5 mL祖师麻粉提取液加入4.5 mL PBS缓冲溶液中，富集后进行线性扫描伏安测定，测得该介质中瑞香素浓度为6.1 μmol/L，计算得祖师麻粉中瑞香素含量为0.11 mg/g。采用标准加入法分别加入1.00、5.00、10.0 μmol/L瑞香素标准溶液进行加标回收实验(n=3)，结果见表1。测得回收率为90.0%～96.0%；相对标准偏差(RSD)分别为4.8%、4.3%、4.5%。进一步用高效液相色谱法验证该方法的可行性，测得回收率为94.0%～98.8%，相对标准偏差不大于3.1%。3D-PSS-rGO/GCE测定祖师麻粉中瑞香素含量与高效液相色谱法基本一致。该传感可以用于祖师麻粉中瑞香素含量的检测。

表1 祖师麻粉中瑞香素的测定Table 1 Determination of daphnetin in girald daphne bark(n=3)

3 结 论

本研究采用绿色环保、简单易行的方法合成了3D-PSS-rGO。基于3D-PSS-rGO优异的导电性能及强吸附富集作用，制备的3D-PSS-rGO/GCE对瑞香素具有明显的电催化活性。在优化实验条件下，瑞香素浓度在0.08～10.0 μmol/L和10.0～60.0 μmol/L范围内，氧化峰电流与其浓度呈良好线性关系，检出限为0.04 μmol/L。本文构筑的电化学传感法操作简便、线性范围宽、灵敏度高，可实现对祖师麻粉中瑞香素的灵敏测定。