张俊俊 王桂珍 尹志龙 刘平臻 汪正威 │文

1 中国科学院西双版纳热带植物园热带森林生态学重点实验室，昆明650223；2 中国科学院大学，北京100049；3 云南普洱学院生物与化学学院

大蜡螟（Galleria mellonellaL.）是蜜蜂重要的害虫，其幼虫寄生于蜂巢内，喜上脾吞食蜂巢，善钻蛀隧，损坏蜂巢，又被称为“巢虫”[1]。大蜡螟危害严重时，中蜂群内会产生大量“白头蛹”，导致子脾不能正常羽化[2]，当无法得到控制时便会弃巢飞逃，其幼虫会破坏蜂群内所有空巢脾。而大蜡螟对意蜂的危害则主要表现在侵染弱群，破坏蜜粉脾，给蜂农造成不可估量的经济损失。

图1 大蜡螟生活史（a 卵，b 幼虫，c 蛹，d 成虫）

大蜡螟为完全变态昆虫，生长周期分四个阶段：卵、幼虫、蛹、成虫[1]（图1）。自然条件下，发育期长短随季节变化而略有差异。据报道，大蜡螟卵期8～23天，初产卵呈短椭圆形，卵壳较硬且厚，随孵化时间增加逐渐由乳白色变为黄褐色，表面开始布有网状刻纹，其卵块一般为单层，卵粒紧密排列。大蜡螟幼虫共8龄[1]，每龄期4～7天，因外界温度和食料不同而略有差异，2～3龄幼虫外形会发生很大变化，成熟幼虫体长12～28mm，重量可达240mg；老熟幼虫吐丝结茧化蛹，茧为白色丝织物，厚密结实，两端丝织疏松，呈长椭圆形。蛹期6～55天，蛹呈纺锤形，化蛹初期为淡黄色，羽化前呈褐色或黑色。雌蛾个体较雄蛾大，在自然条件下，雌蛾历期7～9天，体长18～22mm，重达123±2mg，羽化后1～3小时开始交尾，交尾4～5小时后产卵，平均产卵量725±149粒，雄蛾历期1 2～2 4 天，体长14～16mm，重74.0±7mg[1-2,4]。大蜡螟成虫口器退化，在成虫期不取食，危害较大的是幼虫期（巢虫），其幼虫会取食蜂群巢脾，1～2龄幼虫会蛀食巢脾，并在巢脾上吐丝作茧，严重损坏巢脾结构、蛀蚀蜂具[3]。蜡螟幼虫除破坏巢脾外，还会危及蜂群中的封盖子脾。除此之外，3～4龄幼虫会造成蜂群蛹和幼虫大量死亡，使得蜜蜂群势溃败。

大蜡螟是全球范围内普遍存在的蜜蜂害虫，不仅危害蜂群，还威胁蜂产品产量和质量[5]。一对雌雄大蜡螟日产卵量在100～900粒以上，最高可达2000粒，300头蛹日出虫率可达67%以上，并在2天内完成交配，可见蜡螟产卵量之多，出虫率之快，交配率之高，繁殖速率之快，产生的危害之大。但是尚未有能够有效、快速检测蜡螟虫卵数量的方法。本文介绍三种能够在实验室内快速检测大蜡螟虫卵数量的方法，以期找到优化、便捷的虫卵计数法，用于对大蜡螟种群数量变化的动态监测。

一、大蜡螟实验室养殖条件

1.大蜡螟来源

图2 A 直接计数法，B Motic 面积计数法，C PS 像素计数法

采集受大蜡螟侵染的蜂群，实验室人工培养3代后用于试验，培养箱条件为温度27℃～32℃，相对湿度65%～75%。

2.饲料配方

采用黄诚华等[6]研发的优化配方，即每份饲料添加酵母粉5.40g、甘油24.00g、奶粉10.20g、蜂蜜11.76g、蜂蜡16.68g、面粉51.96g。

3.卵块收集

大蜡螟幼虫分批次饲养，每一批次饲养200～400头，再分别用饲养盒分装大幼虫，每盒50～60头。根据大蜡螟雌雄蛹的体型差异判断，在蛹期将大蜡螟按雌雄分开养殖。待蛹羽化后，随机选择雌雄成虫交配产卵，收集当天产下的卵块进行试验。

二、卵块计数方法

首先，随机挑选产卵后的纸片，选出三个卵粒范围的纸片各10张（下称卵片），卵粒范围设置：≤100粒，100～200粒，≥300粒，并给每张卵片依次编号，以供试验使用。分别用人工直接计数法、Motic Images plus 2.0 ML软件面积计数法（简称Motic面积计数法）、Adobe Photoshop软件像素计数法（简称PS像素计数法）计算卵粒数量，并记录每种方法在不同卵粒范围计数时所消耗的时间（图2）。

1.人工直接计数法

选择干净带卵的纸张，按照编号顺序依次在体式显微镜下观察，人工计数，记录每张卵片的虫卵数量。

2.Motic面积计数法

选择干净的卵片，按照编号顺序依次在体式显微镜下观察，将Motic Images plus 2.0 ML软件与体式显微镜连接，使用该软件对每一张卵片进行图片采集，并对每张图片编号保存。随即将图片导回到软件中进行处理，步骤如下：（1）选择测量工具；（2）再选择不规则多边形框选工具，手动对每个图片中虫卵区域进行描边，软件会自动计算出所选择区域面积；（3）最后用该方法随机框选出5颗卵粒面积，并求单粒面积平均值，通过计算可得出：总卵粒数（粒）=总卵粒区域面积/单粒面积平均值。

3.PS像素计数法

选择干净的卵片，按照编号顺序依次在体式显微镜下观察，将Motic Images plus 2.0 ML软件与体式显微镜连接，使用该软件对每一张卵片进行图片采集，并对每张图片编号保存。随后将图片导入到Adobe Photoshop CC 2017软件中使用像素框选计数卵数，步骤如下：（1）选择像素框选工具中的魔棒工具对照片中虫卵区域自动进行框选，容差调为0；（2）再用矩形选框工具，或者椭圆选框工具，手动微调多选和漏选的区域，以减小误差：（3）选框完成后，选择直方图，记录软件直接计算出的像素大小；（4）再用套索工具，随即随机选择5颗卵粒，同样选择直方图，计算其像素平均值，通过计算可得出：总卵粒数（粒）=总虫卵区域像素值/单粒像素平均值。

三、结果与讨论

1.三种方法对三种卵粒范围的卵粒数量

研究结果：三种计数方法分别对同一卵块范围计数，在卵块范围≤100粒时，卵粒数量依次为：直接计数法为61±6.307粒（Mean±SE，下同），Motic面积计数法为65±6.943粒，PS像素计数法为63±5.681粒；在卵块范围在100～200粒时，直接计数法为163±17.704粒，Motic面积计数法为160±15.467粒，PS像素计数法为168±16.700粒；在卵块范围≥300粒时，直接计数法为451±44.708粒，Motic面积计数法为422±35.331粒，PS像素计数法为453±51.636粒。通过对卵粒数量进行单因素方差分析，结果表明：同一卵块范围，不同计数方法的卵粒数量之间的差异均不显著（P＞0.05）；而同一计数方法，不同卵块范围的卵粒数量之间的差异达到极显著水平（P＜0.01）（图3）。

图3 三种方法计数三种卵块范围的卵粒数量

2.讨论

本研究结果说明，Motic面积计数法和PS像素计数法，同样适用于蜡螟虫卵卵粒的计数，无论是较低的卵块范围，还是较高的卵块范围，两种方法均表现出较强的可信度，与人工直接计数法计算的卵粒数差异较小，这两种卵粒计数法均适用于大蜡螟虫卵的计数。当单次产卵总卵粒数小于100粒时，使用人工直接计数法观察计数较此两种方法更节省时间，且具有计数更准确的优点，出现的误差比自动计数法更小。但是，当卵粒数大于100粒以上，随着卵粒数量的增加，三种方法比较可知：人工直接计数法耗时最长，PS像素计数法次之，Motic面积计数法最节省时间。

大蜡螟对蜜蜂的危害，不仅表现在影响蜂群的发展壮大，还会影响其产蜜量及蜂蜡等蜂产品的品质。大蜡螟快速的卵数计数方法，不仅可以帮助我们实时监测大蜡螟的发生、发展规律，更有助于我们快速对其繁殖期虫卵数量进行动态监控，做好蜡螟虫情发生与预测工作，并对大蜡螟防治提供支撑。为了保护传粉昆虫，维持养蜂业的平稳发展，使得蜂农经济效益最大化，对大蜡螟的相关研究刻不容缓。