王诗，王璐璐，赵丹丹，杨学山，韩舜愈，祝霞*

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州， 730070) 2(甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州， 730070)

微生物菌群在葡萄酒发酵过程中产生的次级代谢产物和生物酶，会直接影响酒体中挥发性香气化合物的种类、含量和演变过程，决定着葡萄酒的风格和典型性[1]。由酒酒球菌(Oenococcusoeni)诱发的苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation，MLF)是酿造高品质干红葡萄酒和部分高酸度白葡萄酒的必需工艺，可将酒体中粗糙、尖劣的L-苹果酸转化为柔和、圆润的L-乳酸，对改善口感、提升和修饰挥发性香气成分具有积极作用[2-3]。同时，适应了产区风土的优良本土O.oeni能够与葡萄原料特性更加契合，在MLF过程中可以更加有效地呈现产区微生物风土特色[4-7]。葡萄酒产业发达的国家如法国、意大利、加拿大、葡萄牙等均对本产区O.oeni进行了分离、筛选和发酵性能分析研究，获得了酿酒适应性和发酵特性优良的菌株，并在生产中商业化推广应用，有效提升了葡萄酒的品质和地域风格[8-11]。张春晖[12]、卢新军[13]、薛雪[14]、乔慧等[15]分别对从山东烟台、河北昌黎、宁夏银川、内蒙古等葡萄酒产区筛选、鉴定的本土O.oeni进行酿造适应性研究，结果均表明，发酵特性优良的本土O.oeni菌株应用于葡萄酒MLF后，酒样中香气化合物，尤其是酯类、高级醇等发酵香气物质表现更为丰富、多样，具备酿造差异化明显、典型性突出的优质葡萄酒应用潜力。

甘肃河西走廊地处北纬36～40°，干旱少雨，昼夜温差大，酿酒葡萄种植区以沙质土壤为主，矿物质丰富，具备生产优质葡萄酒的良好生态条件[16]。然而企业在实际生产中大多采用进口发酵剂进行MLF，导致产品同质化问题非常严重，无法适应多元化、个性化的消费市场需求。本实验以甘肃河西走廊葡萄酒产区分离鉴定的4株O.oeni为供试菌株，通过微酿实验分析比较本土菌株与商业菌株OMEGA对赤霞珠(Cabernet Sauvignon)干红葡萄酒香气品质的影响及差异，以期为本土O.oeni菌株的工业化生产应用及酿造代表河西走廊产区风味的葡萄酒提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠葡萄采自甘肃莫高实业发展有限公司武威黄羊河种植基地，可滴定酸(以酒石酸计)5.87 g/L，含糖量约为22.3 Brix°(223 g/L)。

本土O.oeniMG-1、MG-7、QL-11、ZX-1菌株，均由甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室从河西走廊葡萄酒产区分离、鉴定并保存。商业O.oeniOMEGA，购自法国Lallemand公司；酿酒酵母ES488，购自意大利Enartis公司。

L-苹果酸检测试剂盒,爱尔兰Megazyme公司；香叶醇、β-香茅醇、(Z)-橙花叔醇、α-萜品醇、里那醇、β-大马士酮、2-辛醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸甲酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇、戊醇、己醇、金合欢醇、辛酸等香气标准品(色谱纯),美国Sigma公司；蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4、MnSO4、NaOH、无水葡萄糖、HCl、酒石酸、无水乙醇、偏重亚硫酸钠等常规试剂均为国产分析纯，天津光复化工研究所。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LDZX立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；BCD642WDVMU1立式冰箱，青岛海尔股份有限公司；pHS-3C精密pH计，上海雷磁场仪器厂；TRACE 1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪、ISQ单四级杆质谱仪，美国Thermo Scientific公司；DB-WAX气相色谱柱，美国Agilent Technologies公司；50/30 μmDVB/CAR-PDMS固相微萃取装置、萃取头，上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 ATB培养基的配制

ATB基础培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母浸粉5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，盐酸半胱氨酸0.5，番茄汁25%(体积分数)，液体培养基使用1 mol/L NaOH调pH至4.8，固体培养基调pH至5.0，并向其中加质量浓度20 g/L的琼脂，121 ℃灭菌20 min。其中葡萄糖于115 ℃灭菌15 min，在超净工作台内按质量浓度比例混合。

1.3.2 菌株活化

配制ATB液体培养基，121 ℃湿热灭菌20 min后，置于无菌超净工作台中冷却。取冷冻保存的O.oeni菌株，室温下放置2 h后，从斜面培养基上挑取2环接种至配制好的液体培养基中，于28 ℃培养箱中培养，备用。

1.3.3 葡萄酒微酿实验

选用赤霞珠葡萄，参照小容器酿造工艺法[17]完成乙醇发酵后，将乙醇体积分数为12.3%、残糖质量浓度为2.1 g/L、L-苹果酸质量浓度为3.378 g/L的酒样分装入15个2.5 L棕色玻璃瓶，分为5组(n=3)。其中4组分别以体积分数为4%的接种量(1×107CFU/mL)量取活化后的本土O.oeni菌液，3 000 r/min离心10 min后弃去上清液，然后将沉淀用酒样洗入发酵瓶中；对照商业菌株OMEGA按照推荐用量0.02 g/L(质量浓度)接种。置于20 ℃启动MLF，当酒样中L-苹果酸质量浓度≤0.3 g/L时，结束发酵。

1.3.4L-苹果酸含量测定

参照L-苹果酸检测试剂盒推荐的方法，测定发酵酒样中L-苹果酸含量，分析O.oeni菌株的L-苹果酸降解能力。

1.3.5 理化指标测定

参照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中的实验方法进行。残糖：斐林试剂滴定法；酒精：酒精计法；pH：精密pH计测定；总酸：酸碱滴定指示剂法，结果以酒石酸(g/L)计；挥发酸：水蒸气蒸馏法，结果以乙酸(g/L)计；总SO2：碘量法。

1.3.6 挥发性香气成分分析

参照祝霞等[19]的香气物质萃取方法及GC-MS条件，略作修改。各发酵酒样重复测定3次。

1.3.6.1 香气成分富集

取8 mL待测酒样加入15 mL顶空瓶中，同时加入2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(质量浓度88.2 mg/L)，加磁力搅拌转子后用封口膜封口并摇匀，放入恒温加热磁力搅拌器中，40 ℃水浴平衡30 min，然后插入萃取针(旋出萃取头)顶空萃取30 min。

1.3.6.2 GC-MS条件

GC条件：色谱柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，进样口温度240 ℃，传输线温度230 ℃，离子源温度250 ℃，不分流进样；载气(He)流速1 mL/min；进样时间5 min；柱温升温程序：40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min。

MS条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70 eV；传输线温度180 ℃；离子源温度200 ℃；质谱扫描范围m/z50～350。

1.3.6.3 定性与定量分析

目标化合物采用保留指数(retention index，RI)、NIST-11、Wiley和香精香料谱库检索比对，结合谱图分析进行定性。利用标准曲线(R2>0.995)对已有标准品的高级醇、酯类、萜烯类化合物，进行定量，无标准品的化合物采用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标准物质进行半定量。

1.3.7 感官评价

参照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及祝霞等[20]的方法，略作修改。各酒样随机编号后，由9名经过葡萄酒品鉴培训的人员(5女，4男)进行3轮盲品，分别从外观、香气和口感方面，以具体评价角度对各酒样进行品评。使用10分结构化数值尺度来量化，0～10分表示感觉强烈程度逐渐增大。

表1 葡萄酒感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of wine

1.4 数据处理与分析

对供试样本(n=3)所得数据采用Microsoft Office Excel 2013、Origin 2018进行基本处理和作图，采用IBM SPSS Statistics 19.0软件进行Duncan’s多重比较以及差异显著性分析，并对香气化合物进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 结果与分析

2.1 干红葡萄酒微酿实验

2.1.1 葡萄酒MLF期间L-苹果酸含量变化

图1所示为酒精发酵结束后，分别接种4株O.oeni进行MLF时，L-苹果酸含量的变化趋势。除对照组酒样(未接菌，CK)外，其余葡萄酒中L-苹果酸含量均呈下降趋势。不同菌株对L-苹果酸的分解速率存在一定差异。刚接入菌株1 d时，所有菌株均能分解葡萄酒中的L-苹果酸。其中ZX-1发酵的葡萄酒中L-苹果酸含量下降最快，24 h时L-苹果酸含量约从3.400 g/L迅速降至2.600 g/L，相比其他菌株降酸速率最快。在随后的第2～6天，MG-1酒样分解速率缓慢，在此期间L-苹果酸含量共降低了约0.400 g/L，降酸速率最低；但在6 d之后，MG-1酒样中L-苹果酸含量开始以约0.600 g/L的速率下降，快速消耗葡萄酒中L-苹果酸。当L-苹果酸含量降至0.300 g/L时，所有菌株降酸速率均变得缓慢。在MLF 9 d后，ZX-1最先完成发酵，处理的酒样中L-苹果酸含量仅剩0.008 g/L，其次是MG-1(11 d)，而QL-11和MG-7完成MLF分别用时13和14 d；而OMEGA菌株在第13天时，L-苹果酸含量为0.283 g/L，未接菌的对照组CK酒样苹果酸含量几乎无变化。结果表明，所有菌株均具有良好的降解L-苹果酸的能力。

图1 葡萄酒MLF期间L-苹果酸含量变化Fig.1 Changes of L-malic acid content in wine during MLF

2.1.2 MLF后葡萄酒基本理化指标

对MLF前后的葡萄酒样进行基本理化指标的测定，结果见表2。

表2 苹果酸-乳酸发酵前后葡萄酒样理化指标Table 2 The physical and chemical indexes of wine sample before and after MLF

由表2可知，供试菌株均能够分解葡萄酒中的L-苹果酸，降低葡萄酒的总酸含量，使pH升高，并顺利完成MLF，而在未加菌的对照组酒样中，L-苹果酸含量变化不大。其中O.oeniZX-1和MG-1几乎能够完全发酵葡萄酒中的L-苹果酸，使总酸含量更低。总体而言，MLF后的赤霞珠干红葡萄酒基本理化指标均符合国标GB 15037—2006《葡萄酒》的要求。

2.2 葡萄酒样香气成分分析

2.2.1 不同菌株MLF后酒样香气成分GC-MS分析

采用HS-SPME/GC-MS对未接菌酒样及商品菌OMEGA和4株本土酒酒球菌MLF后酒样产生的挥发性香气物质进行分析，结果见图2。

由图2可知，实验共检出90种香气物质，其中醇类22种、酯类38种、酸类11种、萜烯类13种和其他类6种。其中，QL-11和MG-7菌株发酵的酒样中均检出78种香气成分，是检出香气物质种类最多的2株菌，且菌株QL-11是所有菌株中香气物质总含量(15.16 mg/L)最高的菌株；MG-1和ZX-1分别检出香气物质67种(总含量13.76 mg/L)和71种(总含量14.33 mg/L)；OMEGA酒样中共检出62种香气物质(总含量13.43 mg/L)；而CK葡萄酒样中共检测到58种香气成分(总含量12.60 mg/L)。

不同菌株发酵的酒样产生同类香气物质的种类和含量存在差异。实验共检出酯类化合物38种，是5种处理酒样中检出种类最多、含量最高的香气物质。其中QL-11是检出酯类最多的菌株，共35种(总含量6.92 mg/L)；其次为MG-7，共检出33种(总含量5.11 mg/L)，而CK酒样中检出酯类化合物最少，为25种(总含量6.24 mg/L)。在6种处理下，辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯等具有的菠萝、香蕉以及花香味成分均有检出[21]；而己酸甲酯、十四酸乙酯、水杨酸甲酯等具有的菠萝、奶油味、冬青味和葡萄味化合物[22]在接种了本土O.oeni的酒样中均有检出，而在未接菌的CK酒样和接种了商品菌OMEGA酒样中均未检出；在QL-11酒样中检出具有花香、苹果等果香味的化合物乙酸辛酯，而在其他酒样中均未检出。

a-酯类物质；b-高级醇类物质；c-酸类物质；d-萜烯类物质；e-其他类物质图2 葡萄酒挥发性香气成分的GC-MS分析Fig.2 Volatile aroma components of wines by GC-MS analysis注：不同小写字母表示样品间具有显著性差异(P<0.05)

QL-11是产高级醇种类和含量最多的菌株，分别为19种和6.65 mg/L。在进行了MLF的酒样中主要检出3-甲基-1-戊醇、月桂醇、2,3-丁二醇、4-甲基-1-戊醇等具有溶剂味、花香果香、黄油味、烘烤味的香气成分[23]，而CK酒样中未检出。

有机酸类物质种类较多的酒样为MG-7(总含量1.09 mg/L)和CK(总含量1.08 mg/L)，均检出10种物质；酸类化合物种类和含量检出均最少的为MG-1酒样，共6种(总含量0.94 mg/L)，其中检出含量最高的酸为带有奶油味的辛酸[24]，在OMEGA酒样中含量最高，为0.89 mg/L。

萜烯类和其他类化合物是所有酒样中检出总体含量较少的香气物质。其中菌株ZX-1发酵的酒样检出萜烯类化合物的种类和含量均为最高，共12种(总含量0.20 mg/L)，而其他类化合物共检出5种(总含量0.12 mg/L)。同时，其他类物质以MG-7检出种类最多(6种)，但含量(0.02 mg/L)最低。所有接种本土O.oeni发酵的酒样中检出萜烯化合物种类和含量均高于CK和OMEGA酒样。主要检出萜烯类化合物为β-紫罗兰酮、金合欢醇和萜品醇等具有花香、果香、植物香的物质[25]。检出其他类化合物有β-环柠檬醛、香茅醛及2,4-二叔丁基苯酚等香气物质[26]。综合分析可知，使用本土O.oeni进行MLF的酒样酯类、醇类和萜烯类化合物含量均有增加，OMEGA发酵的酒样中黄油味、乳酪味和烘烤香气物质更为突出。其中乳酸异戊酯、2,3-丁二醇、2-壬醇、2-甲基丁酸、β-紫罗兰酮、金合欢醇及β-环柠檬醛等物质能够丰富葡萄酒的花香、果香味，但在CK组中未检测到。从香气物质种类和总含量来看，QL-11和ZX-1能够产生更多的香气物质。

2.2.2 不同菌株MLF后酒样香气化合物主成分分析

不同O.oeni菌株对酒体挥发性香气成分的影响较为复杂，且不同菌株发酵的酒样间香气化合物种类及含量存在差异[27]。为进一步探究不同O.oeni进行MLF后酒样在香气成分上的整体差异，采用PCA多元统计法研究挥发性香气化合物的变化[28]。以特征值>1提取主成分，得到PC1、PC2和PC3的方差贡献率分别为46.385%、19.882%和16.985%，3个主成分累计方差贡献率为83.252%，基本能够反映原数据83.252%的变异信息。各香气物质在PC1、PC2和PC3上的因子载荷如图3所示，香气化合物酒样分布见图4。

由图3可知，PC1主要反映了A22(壬酸乙酯)、A24(癸酸甲酯)、B10(辛醇)、B14(2,4-丁二醇)、C3(2-甲基丁酸)、C8(辛酸)、D7(橙花醇)、D8(香叶醇)等酯类物质及具有水果、奶油、乳香味的醇类、酸类以及具有花果香的萜烯类香气化合物的变异信息；化合物C10(乙酸)、D1(β-大马士酮)等与PC1高度负相关。PC2主要体现了B16(苯甲醇)、B22(2-壬醇)、C4(癸酸)、D6(金合欢醇)、D10(α-松油醇)等具有水果香、奶酪等香气物质信息，而PC2负半轴香气物质主要为A11(丙酸异戊酯)、A33(癸酸异戊酯)、A13(丁酸异戊酯)、A6(3-甲基丁酸乙酯)等酯类物质。PC3正半轴上得分较高的主要为B18(4-甲基-1-戊醇)、A14(辛酸异丁酯)、A7(戊酸乙酯)、B2(丁醇)、B13(3-甲基-1-戊醇)等香气化合物，这些化合物能够赋予葡萄酒丰富的花果香味；而其负半轴区域有突出表现的香气成分主要为A17(反式-2-己烯酸乙酯)、A23(辛酸正丁酯)、B11(反式-2-辛烯-1-醇)、B19(反式-3-己烯-1-醇)、C5(己酸)、D2(香叶基丙酮)等具有青草味和乳味的香气物质。

a-PC1-PC2; b-PC1-PC3图3 香气化合物主成分分析的因子载荷图Fig.3 Factor loadings plot of PCA for volatile aromacompounds

由图4可知，CK和MG-7酒样可聚为一类，在PC2负半轴及PC3负半轴上得分较高，表明丙酸异戊酯、癸酸异戊酯、3-甲基丁酸乙酯、反式-2-辛烯-1-醇、香叶基丙酮等具有紫丁香、青草味的香气物质含量较高。位于香气物质更加聚集区域的QL-11和MG-1，其PC1正半轴和PC3正半轴上得分均较高，主要代表了具有浓郁花香、果香和乳香味的酯类和高级醇类物质的香气特征信息。ZX-1酒样代表了PC1正半轴和PC2正半轴以及PC3负半轴上的特征香气物质信息，这一区域香气物质丰富多样，主要为乙酸乙酯、庚酸乙酯、苯甲醇、2-甲基丁酸、橙花醇、香叶醇等高级酯、高级醇及萜烯类香气成分，这些物质可使葡萄酒具有更浓郁的花香、果香和乳香等MLF特征香气物质，增加葡萄酒香气复杂性。而OMEGA酒样主要分布于PC1负半轴和PC3正半轴，代表了异丁酸、9-癸烯酸等具有黄油、脂肪味的有机酸类以及2-乙基己醇、异丁醇、丁二酸二乙酯、乙酸辛酯等具有花香、苹果等甜果香味的酯和醇类。

图4 香气化合物主成分分析的酒样分布图Fig.4 Score plot of wine samples for PCA of the volatilearoma compounds

2.3 感官结果分析

图5为不同菌株MLF赤霞珠干红葡萄酒感官分析雷达图。

图5 赤霞珠干红葡萄酒感官分析雷达图Fig.5 Radar map of sensory analysis for CabernetSauvignon dry red wine

由图5可知，在色泽方面CK与OMEGA、MG-7、MG-1、QL-11和ZX-1菌株发酵酒样并无明显差异；从口感方面分析，MLF可使酒样的口感变得更加柔和圆润。QL-11菌株发酵酒样的花香、果香味较为突出，而MG-7、MG-1、ZX-1菌株的花香、果香、余味长短无明显差异，但均高于CK与OMEGA菌株。整体而言，MLF后酒样在香气、余味长短、典型性方面均高于CK，这是因为MLF提高了酒样中的酯类、酸类、醇类化合物含量，与MATURANO等[29]的研究结果一致。综合分析，采用本土O.oeni进行MLF后酒样更有利于花果香的形成，使酒体典型性更突出。

3 结论

赤霞珠干红葡萄酒MLF微酿实验结果表明，4株本土O.oeni均能顺利完成MLF，但发酵时间存在差异，其中ZX-1菌株9 d完成了发酵，降酸能力最强，其次是MG-1(11 d)，而QL-11、MG-7和OMEGA菌株均在14 d左右完成了MLF，且发酵酒样理化指标均符合国标(GB/T 15037—2006《葡萄酒》)要求；香气化合物GC-MS分析检测结果表明，与未进行MLF的(CK)酒样相比，接种本土O.oeni进行MLF的酒样挥发性香气物质更加丰富、多样，其中QL-11菌株发酵酒样中酯类、醇类、萜烯类等化合物含量明显增多，表现为更浓郁的花香、果香味；而商品菌株OMEGA发酵酒样中黄油、脂肪味化合物含量较高，与感官评价分析结果相一致。总体而言，QL-11菌株具有酿造代表甘肃河西走廊产区特色葡萄酒的应用潜力。