岑剑伟，赵敏，杨贤庆，李来好，黄卉，赵永强，魏涯，杨少玲，林织

1(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州，510300)2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306) 3(广东顺欣海洋渔业集团有限公司，广东 阳江，529800)

抗菌肽是在所有生命类别中基本都具备的先天免疫系统的一部分，能够对抗细菌、真菌、病毒以及肿瘤细胞等[1]，并具有生态友好性、低残留、热稳定好、抗菌谱广以及不易产生耐药性等优势，在水产养殖中可以提高鱼类的抗病性或保持食品不受微生物污染[2]，可作为理想的抗生素替代品，在饲料、食品以及医药等行业具有广阔的应用前景[3-4]。

罗非鱼(Oreochromisniloticus)由于具有快速生长、高繁殖率和高适销性等优势，已成为世界第二大常见养殖淡水鱼类[5]。罗非鱼加工产生约60%～70%(质量分数)的副产品，包括肌肉残留物、头部、内脏、皮肤、骨骼和鳞屑[6]。罗非鱼副产物具备作为水产饲料原料的可行性，其水解物具有抗菌、抗氧化和抗高血压等多种生物活性，在水产饲料中引入鱼类副产物水解物可改善鱼类生长性能[7]。尽管罗非鱼养殖产业发展迅速，但也面临由链球菌(Streptococcusspp.)、弧菌(Vibriospp.)和嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)等引起的细菌感染挑战[8]。无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是与各种水生动物(特别是罗非鱼)相关的重要病原体[9]，已成为中国罗非鱼行业最严重的疾病问题之一，对罗非鱼养殖产业造成巨大的影响[10]。有报道称，罗非鱼副产物酶解肽在体外对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)和鲁氏耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)具有抗菌活性[11-12]。但关于抑制无乳链球菌的罗非鱼副产物抗菌肽的研究尚未有报道。

本研究的目的在于通过蛋白酶水解罗非鱼副产物制备抗菌肽，通过前期的蛋白酶及抑菌目标菌种探索得出，由酸性蛋白酶水解可获得抑制无乳链球菌的抗菌肽，而无乳链球菌正是罗非鱼养殖中迫切需要应对的一种致病菌，因此选择无乳链球菌进行后续抑菌实验。由单因素及正交试验确定酸性蛋白酶酶解的最佳条件，抗菌活性依次通过琼脂孔扩散法和微孔板检测法在体外进行评估，并对罗非鱼副产物酶解肽的氨基酸组成和分子质量分布进行测定，以评估其营养和功能特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

罗非鱼，取罗非鱼副产物(鱼头、鱼骨、鱼皮、内脏等)绞碎，置于聚乙烯袋内于-80 ℃冻藏备用，广州华润万家超市；无乳链球菌，中国水产科学研究院南海水产研究所鱼病室；木瓜蛋白酶(3 500 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、酸性蛋白酶(50 U/mg)、胃蛋白酶(10 000 U/mg)，合肥博美生物科技有限责任公司；Protamex (1.5 AU/g)、Alcalase 2.4 L(2.4 AU/g)，丹麦诺维信公司；脑心浸萃(brain heart infusion,BHI)琼脂培养基、MH肉汤(mueller-hinton broth,MHB)培养基，广州领驭生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

809Titrando自动电位滴定仪，瑞士万通公司；Alpha1-4冷冻干燥机，德国Christ公司；Sunrise-basic吸光酶标仪，瑞士TECAN公司；3K30台式高速冷冻离心机，德国Sigma公司；THZ-82水浴恒温振荡器，金坛市精达仪器制造厂；SQ510C立式压力蒸汽灭菌器，日本雅马拓公司；LC-20AD高效液相色谱仪，日本岛津公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州净化设备有限公司；WGZ-2XJ细菌浊度计，上海昕瑞仪器仪表有限公司；835-50型高速氨基酸自动分析仪，日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 罗非鱼副产物抗菌肽粗酶液提取中酶的筛选

取绞碎的罗非鱼副产物解冻后以1∶2(g∶mL)加入去离子水均质至混合物，调整不同pH，选用酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Protamex和Alcalase 2.4 L蛋白酶分别酶解罗非鱼副产物，在其最适条件下恒温水浴振荡不同时间，再经15 min沸水浴灭酶，冷却后于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液进行抽滤、冷冻干燥后即得罗非鱼副产物酶解肽粉末。6种蛋白酶的酶解条件见表1。然后取不同酶解条件的冻干肽粉末配制质量浓度为100 μg/μL的肽溶液，分别进行下述1.2.5中牛津杯法抑菌实验，以及通过1.2.7中96孔板法测定各个酶解条件所得肽的抑菌活性。

表1 各类蛋白酶的酶解条件及添加量Table 1 Hydrolysis conditions and dosages of various proteases

1.2.2 单因素试验

按照1.2.1中方法进行酶解，以对无乳链球菌的抑菌活性为指标，分别考察酸性蛋白酶的酶解时间(2、3、4、5、6 h)、酶解温度(30、35、40、45、50 ℃)、酶解pH(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5)、料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)(g∶mL)以及酶添加量(质量分数0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%)对该指标的影响。固定条件：酶解时间5 h、酶解温度为40 ℃、pH 2.0、酶添加量为0.6%(质量分数)、料液比1∶3(g∶mL)，每次改变其中1个因素，其他因素不变进行酶解，并对其进行1.2.3中水解度测定。然后取各酶解条件的冻干肽粉末配制质量浓度200 μg/μL的肽溶液进行下述1.2.5中抑菌实验。

1.2.3 水解度测定

采用电位滴定法[13]测定氨基态氮质量浓度，凯氏定氮法[14]测定罗非鱼副产物中的总氮质量浓度。

(1)

1.2.4 无乳链球菌菌悬液配制

取1环无乳链球菌接种至100 mL BHI液体培养基，30 ℃振荡24 h培养菌液。在比浊管内用无菌水稀释该菌液至其麦氏浊度值(McFarland，MCF)约为0.5(0.5 MCF相当于108CFU/mL)，然后稀释2个梯度至106CFU/mL。

1.2.5 抑菌活性测定

采用牛津杯抑菌圈法[15]，在无菌条件下，将牛津杯置于培养皿中央，吸取1 mL 106CFU/mL的菌液于冷却至50 ℃左右的100 mL灭菌BHI琼脂培养基中摇匀，倾注平板(约20 mL/平板)后静置。凝固后将牛津杯用镊子垂直拔出，吸取配好的肽溶液约200 μL注入孔中。由于酶解过程中用到盐酸，故于平板孔中注入等pH盐酸作阴性对照，并添加质量浓度50 μg/mL的氯霉素溶液作阳性对照，等量无菌水作空白对照。将培养皿置于30 ℃培养箱中24 h后以游标卡尺用十字交叉法测量抑菌圈直径，以此评价其抑菌活性。重复3次抑菌实验取平均值。

1.2.6 正交实验

在单因素实验的基础上，以抗菌肽抑菌圈直径为响应值，选择对其影响较大的酶解时间、酶解温度、料液比及酶添加量为4个因素，采用L9(34)正交实验进行酶解条件的优化，因素水平设计见表2。

表2 正交试验因素水平设计Table 2 Factors and levels for orthogonal array design

1.2.7 罗非鱼副产物抗菌肽最小抑菌浓度测定

参考李朝等[16]方法，采用96孔板二倍稀释法进行抑菌实验，设实验组为3个平行、阳性对照和阴性对照。预先于所有微孔中加入100 μL的MHB培养基，各组操作如下：实验组为第1列微孔中加入100 μL配好的罗非鱼副产物抗菌肽溶液，与预先添加的MHB培养基充分混合后，吸取100 μL混合液注入第2列，再次充分混合，逐级稀释至最后1列时吸出100 μL弃去，最后于各微孔中添加100 μL菌液；阴性对照与其类似，第1列加入抗菌肽溶液，逐级稀释后，于各微孔中添加100 μL无菌水；阳性对照为各微孔中注入100 μL菌液。

最后将微孔板于30 ℃下培养24 h后置于酶标仪中于600 nm波长下读取吸光值，并根据吸光值确定该抗菌肽溶液对无乳链球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibit concentration,MIC)值。

1.2.8 罗非鱼副产物抗菌肽分子质量测定

采用高效体积排阻色谱(high-performance size-exclusion chromatography,HPSEC)法[17]测定罗非鱼副产物抗菌肽的分子质量(molecular weight，MW)分布，流动相V(含1 g/L三氟乙酸的乙腈)∶V(含1 g/L三氟乙酸的超纯水)=20∶80，色谱柱为TSK-GEL®G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)，流速0.5 mL/min，进样体积10 μL，检测波长214 nm，分别用流动相配制2 mg/mL的不同相对分子质量的标准样品溶液：还原性谷胱甘肽(MW307.3)、L-氧化型谷胱甘肽(MW612.63)、杆菌肽(MW1422.69)、细胞色素C(MW12 500),按照一定比例混合后，用0.22 μm微孔滤膜过滤后进高效液相色谱仪，按照上述色谱条件进行分析，以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间(t)作图，得到标准品色谱图及分子质量回归方程：lgMW=-0.180 2t+6.570 7，最后用峰面积归一法计算多肽相对分子质量的分布情况。

1.2.9 酶解肽冻干粉氨基酸组成测定

按GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》中的酸水解法测定16种基本氨基酸[18]；按GB/T 18246—2019《饲料中氨基酸的测定》中的碱水解法测定色氨酸和氧化酸水解法测定胱氨酸[19]。

1.3 数据分析

利用Excel 2016和SPSS Statistics 22.0统计学软件进行处理、分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

6种蛋白酶不同酶解条件所得肽溶液对无乳链球菌的吸光值测定结果如图1所示。在酶解时间≥1 h时，酸性蛋白酶实验组吸光值较低，与阴性对照基本一致，表明无乳链球菌的生长受到抑制；而胃蛋白酶酶解肽在时间≥2 h时的吸光值较低，此时无乳链球菌受到抑制。其他酶解条件实验组吸光值与阳性对照一致，表明无乳链球菌正常生长。因此得出酸性蛋白酶和胃蛋白酶解肽对无乳链球菌的抑菌效果显著优于其他蛋白酶。施永清等[ 20]以鲫鱼鱼鳞为原料通过碱性蛋白酶结合酸性蛋白酶分步酶解得到具有较强抑菌活性的抗菌肽，对副溶血性弧菌的抑菌圈直径为27.72 mm。王焙等[21]以酸性蛋白酶酶解鲣鱼暗色肉制备抗菌肽，其对大肠杆菌具有较好的抑菌效果，酸性蛋白酶的酶切作用范围广，主要作用于C端的某些疏水性氨基酸残基，导致疏水性基团暴露，易水解出具有抑菌活性的多肽。再通过对二者抑菌圈直径大小的比较(数据未显示)，发现酸性蛋白酶的抑菌效果优于胃蛋白酶，因此选取酸性蛋白酶进行下一步的单因素酶解实验。

图1 各类蛋白酶酶解液对无乳链球菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of various protease hydrolysateson S. agalactiae

2.2 酸性蛋白酶单因素酶解罗非鱼副产物抑菌试验及水解度的测定

如图2-a所示，随酶解时间的延长，抑菌圈直径和水解度均呈上升趋势，5 h后无明显增加，因此酶解5 h较佳。图2-b表明，随酶解温度的升高，抑菌圈直径和水解度均先升高后下降。温度过高会引起酶变性失活，因此最佳温度为40 ℃，符合酸性蛋白酶的最适温度范围。由图2-c可知，pH 1.5时，抑菌圈直径最大而水解度最小。通过等pH盐酸的抑菌对照发现在pH值<1.5时酸性本身具有抑菌效果，因此为了排除其影响选取pH 2.0进行后续实验。这与顾晨涛等[22]的试验结果一致，通过胃蛋白酶酶解鲫鱼鱼鳞得到pH值为1.5的抗菌肽粗酶液。这可能是由于环境pH可直接影响酶活力，在特定pH下，酶分子才会与底物蛋白更好地结合。这说明该抗菌肽在酸性条件下更易发挥抗菌效果。如图2-d所示，抑菌圈直径随酶添加量的增加而先增大后减小，这可能是由于酶量的增加抑制了底物扩散，反而使反应速率降低[23]，因此该酶的最佳添加量为0.8%(质量分数)。图2-e表明，随蒸馏水体积的增加，抑菌圈直径逐渐增大，可能是副产物比例越低，酶解效果越好，得到的抑菌多肽数量越多，然而随着水量继续增加，与底物结合的酶添加量一定，酶解程度达到极限，从而抑菌效果上升不明显，因此确定最适料液比为1∶4(g∶mL)。

2.3 正交试验

通过单因素试验发现4个因素在一定pH范围内会对抑菌活性产生明显影响，所以设计正交试验时只考虑酶解时间、酶解温度、料液比、酶添加量这4个因素。以抑菌圈直径为指标，正交试验的结果如表3所示。

a-酶解时间;b-酶解温度;c-酶解pH;d-酶添加量;e-料液比图2 酶解时间、温度、pH、酶添加量和料液比对抑菌效果和水解度的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time，temperature，pH，enzyme dosage and solid-liquid ratio on antibacterial effectand the degree of hydrolysis

表3 L9(34)正交实验设计及优化结果Table 3 L9(34) orthogonal experimental design andoptimization results

由极差R可知，各因素对抑菌圈直径的影响顺序依次为:酶解温度>料液比>酶解时间>酶添加量，所选因素中温度的影响较大。并得出最佳酶解条件为A2B2C3D1，即酶解时间5 h，酶解温度40 ℃，料液比1∶5(g∶mL)，酶添加量0.7%(质量分数)，对得到的最佳酶解条件进行验证，3组平行实验得到抑菌圈直径为23.38 mm。根据抑菌圈直径≥20 mm为极敏，直径在15～20 mm为高敏，直径在10～15 mm为中敏，直径<10 mm为低敏的标准[24]，罗非鱼副产物抗菌肽溶液质量浓度为200 μg/μL时，抑菌圈直径为23.38 mm，表明无乳链球菌对该抗菌肽溶液极敏，在此质量浓度下具有良好的抑菌活性。

2.4 罗非鱼副产物抗菌肽对无乳链球菌的MIC值

最优酶解条件所得多肽溶液对无乳链球菌的MIC实验结果如图3所示，当肽溶液质量浓度≥12.5 μg/μL时，实验组与阴性对照的吸光值基本一致，表明无乳链球菌的生长受到抑制；当肽溶液质量浓度<12.5 μg/μL时，实验组与阳性对照的吸光值基本一致，表明无乳链球菌正常生长。因此，该罗非鱼副产物抗菌肽对无乳链球菌的MIC值为12.5 μg/μL。

图3 罗非鱼副产物抗菌肽对无乳链球菌的MIC值Fig.3 Minimum inhibitory concentration of tilapia by-product antibacterial peptides against S. agalactiae

2.5 罗非鱼副产物抗菌肽分子质量分布

图4-a为最优酶解条件所得罗非鱼副产物多肽的HPSEC图谱，其分子质量百分比分布如图4-b所示。由图4可知，该多肽组分主要由低分子质量级(<3 kDa)组成，占68.08%(质量分数)，表明酶解后罗非鱼副产物蛋白质在很大程度上降解为小肽或游离氨基酸，该抗菌肽极有可能是小分子多肽。通常认为分子质量是决定肽生物活性的重要因素[25]，分子质量越小的短肽具有越好的水溶性，易于被人体肠胃吸收利用，尤其是一些寡肽由于氨基酸组成以及排列顺序的不同，具有非常重要的生物活性[23]，而对于其中抑菌活性最佳组分分子质量的确定还有待进一步的分离纯化探究。

a-HPSEC图谱；b-各肽段分子质量所占百分比图4 罗非鱼副产物抗菌肽的分子质量分布Fig.4 Molecular weight distribution of antibacterial peptidesfrom tilapia by-products

2.6 罗非鱼副产物酶解冻干粉蛋白氨基酸组成分析

除了多肽的分子质量大小，其氨基酸组成对抗菌活性也很重要。最优酶解条件所得冻干粉的氨基酸组成如表4所示，共检测到18种氨基酸，含量最多的氨基酸按顺序依次为谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和天冬氨酸(Asp)，而Glu占氨基酸总量的14.24%(质量分数)，必需氨基酸占氨基酸总量的32.32%(质量分数)。这与ROBERT等[11]的研究结果一致，通过Protamex酶解罗非鱼副产物制备抗菌肽，得到Glu、Gly和Asp含量最高的酶解产物，并发现其对鲁氏耶尔森氏菌等具有抗菌活性。抗菌多肽链中脯氨酸(Pro)和Gly的富集对其生物活性发挥着重要作用[26]。本实验测得罗非鱼副产物酶解物中Pro和Gly的总量占氨基酸总量的19.48%(质量分数)，含量较高，这可能是其具有抑菌活性的原因。并且该酶解物具有均衡的氨基酸组成，所有必需氨基酸的质量分数均高于食肉鱼虹鳟鱼所定义的氨基酸要求[11]，证实了其在水产饲料中的应用潜力。

3 结论

本研究在单因素实验的基础上，利用正交实验得到酸性蛋白酶酶解罗非鱼副产物的最佳工艺：酶解时间5 h，酶解温度40 ℃，pH 2.0，料液比1∶5(g∶mL)，酶添加量0.7%(质量分数)。此条件下制备的酶解液对无乳链球菌的抑菌圈直径为23.38 mm，MIC达到12.5 μg/μL，分子质量有68.08%分布在3 000 Da以下，并具有均衡的氨基酸组成，证明了其营养潜力。本研究对罗非鱼副产物酶解肽的抑菌活性进行了初步分析，发现其可能具有治疗罗非鱼无乳链球菌感染的巨大潜力，可被视为有希望的无乳链球菌抑制肽来源。为进一步提高其抑菌效果和实用价值，还需对其进行分离纯化、质谱鉴定、作用机理、广谱抗菌性和生物体内实验等深入探究，为后续预防和治疗水产养殖中细菌感染药物的开发、在食品工业中用作抗菌肽的天然食品成分以及畜牧业饲料加工中的应用提供理论支持。