高慧，刘松*

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122) 2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13，transglutaminase,TGase),能催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基(酰基供体)转移至赖氨酸残基的ε-氨基(酰基受体)，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键，导致蛋白质分子发生交联[1]。目前，TGase已被广泛应用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白类食品的质构改良[2]。随着对其催化本质认识的加深，TGase的应用开始向生物制药[3]、制革、纺织[4]及生物技术[5]等多个非食品领域拓展。1989年，日本天野公司首次从土壤中分离了1株能够分泌TGase的茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)[6]。与其他来源的TGase相比，微生物发酵生产的TGase具有非Ca2+依赖性的特点，且生产周期短，成本优势明显。随着应用领域的拓展，链霉菌TGase的产量及酶学性质(底物特异性及热稳定性)的研究逐渐限制了对它的应用需求。构建高产TGase的基因工程菌，并进行酶学性质改造成为相关领域的研究热点。

链霉菌TGase是一种胞外酶，在野生菌中以无活性的酶原(pro-TGase)形式分泌，pro-TGase被内源的蛋白酶切除N端酶原区后，转化成活性TGase。由于N端酶原区对TGase的正确折叠及分泌有重要影响[7-9]，通常其在异源宿主中需以pro-TGase形式表达。值得注意的是，细菌和真菌异源表达宿主通常缺少能专一切割pro-TGase酶原区的蛋白酶。因此，如何将pro-TGase高效转化为活性TGase成为其异源表达的关键。目前，主要有3种策略获得活性重组TGase：(1)共表达pro-TGase与特异性蛋白酶(SAM-P45[10]或人鼻病毒3C蛋白酶[11])；(2)共表达酶原区与TGase[8,12-13]；(3)仅表达pro-TGase，体外添加活化蛋白酶[14]。由于共表达蛋白酶可以对TGase的持续降解[10]或缺少共价连接的酶原区促进其分泌[12]，该策略获得的TGase表达量(16.30 U/mL)[15]仍远低于仅表达pro-TGase获得的(51.1 U/mL)[14]。因此，仅表达pro-TGase再体外添加蛋白酶活化的策略，对于制备活性TGase仍具有产量和成本优势。

目前，用于切割N端酶原区使pro-TGase活化的蛋白酶可以从产TGase的野生菌中分离(如S.mobaraensis金属蛋白酶TAMEP)[16-17]或其他链霉菌中提取(如Streptomycesalbogriseolus分泌的SAM-P20、SAM-P26及SAM-P45等)[18]。此外，一系列商品化的蛋白酶同样能活化pro-TGase，如dispase、中性蛋白酶和胰蛋白酶等[19]。与其他的蛋白酶相比，S.mobaraensis来源的TAMEP能够精准地切割pro-TGase的N端酶原区，活化效率更高且不会对活化后的TGase进行持续降解[20]。研究发现，S.mobaraensis来源TAMEP属M4蛋白酶，在野生菌中仅有少量分泌至胞外，且活性受到链霉菌、枯草杆菌蛋白酶抑制剂的抑制[16,20-21]。最近，S.mobaraensisTAMEP被成功表达于大肠杆菌，但仅存在于细胞周质空间，并不利于其大规模发酵制备[20]。基于此，实现TAMEP高效分泌表达将有助于降低重组pro-TGase的活化成本，提高TGase生产效率。

本研究将来源于S.mobaraensis的TAMEP表达于大肠杆菌，通过信号肽类型优化、信号肽N端密码子同义替换及诱导条件优化，实现了TAMEP的高效分泌，并分析了其酶学性质及对pro-TGase的活化效率。研究结果将有助于TAMEP的规模化制备。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株与质粒：表达质粒pET-22b(+)、大肠杆菌EscherichiacoliJM109和E.coliBL21(DE3)由本实验室保存。产S.mobaraensispro-TGase的生产菌Yarrowialipolytica/pINA1297/TGase由本实验前期构建[22]。编码S.mobaraensisTAMEP及天然信号肽TSP基因[20]的质粒pUC18/TSP-TAMEP由上海生工合成。

LB培养基(g/L)：酵母提取物 5，胰蛋白胨10，NaCl 10。TB培养基(g/L)：胰蛋白胨 12，酵母提取物 24，K2HPO4·3H2O 16.37，KH2PO42.31，甘油 5。Y.lipolytica发酵培养基(g/L)：甘油 15，酵母膏 20，NH4Cl 2.64，KH2PO40.32，MgSO40.25，维生素B13.34×10-4，调pH至8.0。YPD培养基(g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。LB培养基、TB培养基在接种前需加入终质量浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素。

酶、试剂、引物和DNA测序：限制性内切酶、DNA聚合酶购自Takara公司。dispase、GSH、质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒和抗生素购自上海生工公司。Z-Gln-Gly-OH、L-谷氨酸-γ-单羟肟酸、组氨酸标签蛋白抗体和显色剂购自赛默飞公司。BCA蛋白浓度检测试剂盒和SDS-PAGE试剂盒购于碧云天公司。引物构建、DNA测序由上海生工公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 TAMEP表达质粒的构建与转化

以pUC18/TAMEP为模板，分别用引物对TSPTAMEP1/TAMEP2和TAMEP1/TAMEP2进行PCR扩增，得到片段TSP-TAMEP(天然信号肽TSP基因+TAMEP基因)和TAMEP。PCR反应条件为： 98 ℃预变性90 s；随后进行30个循环扩增(98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s)；最后72 ℃保温5 min。将TSP-TAMEP和TAMEP分别克隆至pET-22b(+)的NdeI-XhoI和NcoI-XhoI酶切位点，得到表达载体pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP。将所得表达载体转化E.coliBL21(DE3)，得到重组菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。质粒构建相关引物见表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 优化TAMEP信号肽N端密码子同义随机替换

以Mut-A1、Mut-A2、Mut-A3、Mut-A4、Mut-A5、Mut-A6、Mut-A7、Mut-A8为上游引物，以Mut-B为下游引物，对pET22b-TSP-TAMEP进行PCR扩增，在TAMEP信号肽TSP的 N端前10个氨基编码基因中随机引入同义密码子。PCR反应条件为： 98 ℃预变性90 s；随后进行30个循环扩增(98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min)；最后72 ℃保温5 min。PCR产物混合，并经DpnI处理后转化，转化后涂布氨苄青霉素抗性的LB培养基平板。挑取转化子至含LB培养基的96深孔板中培养，37 ℃培养8 h；转接装有TB培养基的96深孔板，37 ℃培养2 h，加入终浓度10 μmol/L IPTG，20 ℃继续培养40 h。将高产转化子转接摇瓶培养复筛。

1.2.3 重组菌发酵优化

重组大肠杆菌发酵：取TAMEP生产菌液100 μL接入LB培养基，37 ℃培养10 h转接至TB培养基于37 ℃培养；当菌体OD600达到一定值(0.5～3.0)时，加入一定量的IPTG(0～200 μmol/L)，同时降温培养(16～30 ℃)培养40 h；为提高TAMEP胞外表达水平，分别添加2～10 g/L的甘氨酸、葡萄糖或体积分数为0.2%～1.0%乙醇。各培养基使用前添加终质量浓度50 μg/mL的氨苄青霉素。

重组Y.lipolytica发酵：将pro-TGase生产菌液接种于YPD液体培养基中，于28 ℃培养24 h；将种子液以10%的接种量转接于发酵培养基中，于28 ℃摇瓶培养120 h。

1.2.4 蛋白质分离纯化

采用镍柱对TAMEP及pro-TGase进行纯化。重组菌发酵上清液经0.22 μmol/L膜过滤制成上样样品。将样品注入经结合缓冲液平衡的镍柱，并用结合缓冲液洗去未结合蛋白；随后以0～500 mmol/L咪唑溶液进行梯度洗脱，收集含有TAMEP或TGase催化活性的部分(pro-TGase样品经dispase活化)。所得纯化样品经脱盐柱去除盐离子。

1.2.5 TAMEP酶学性质检测

最适反应温度：在反应温度为20～80 ℃测定TAMEP活性，以所测得的最高酶活力为100%，计算其他反应温度下的相对酶活力。

最适反应pH：测定pH为5～10条件下TAMEP活性(pH 5：50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6～8：50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液；pH 9～10：50 mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液)，以所测得的最高活性为100%，计算其他反应pH下的相对酶活力。

热稳定性：将TAMEP分别于30～60 ℃下孵育0～60 min后，冰水浴5 min并测定其催化活性，未经热处理的酶活力设为100%，计算其他条件下的相对酶活力。

pH稳定性：将TAMEP用pH为5～10缓冲液稀释相同倍数，于30 ℃水浴中孵育60 min测定酶活力，以测得最高酶活力为100%，计算其他pH下孵育的相对酶活力。

1.2.6 pro-TGase活化分析

将纯化的pro-TGase与不同浓度的TAMEP溶液混合均匀，于37 ℃恒温30 min。在该反应体系中，pro-TGase浓度为6.91 μmol/L，TAMEP浓度分别为0.133、0.066、0.033和0.017 μmol/L。反应开始后，每间隔10 min取样50 μL，进行TGase活力测定；同时取样10 μL与SDS-PAGE电泳上样缓冲液混合于90 ℃加热10 min后进电泳分析。

1.2.7 酶活力检测

按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中福林法测蛋白酶活性方法测定TAMEP酶活力。1 U TAMEP酶活力定义为40 ℃下每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量。以用α-N-CBZ-Gln-Gly和盐酸羟胺为作用底物测定TGase酶活力[7]。1 U TGase酶活力定义为37 ℃每1 min催化生成1 μmolL-谷氨酸-γ-单羟肟酸的酶量。

1.2.8 蛋白质分析

使用BCA蛋白浓度检测和采用碧云天试剂盒制备SDS-PAGE电泳凝胶，具体操作参考产品说明书。使用浓缩胶质量浓度为50 g/L，分离胶质量浓度为120 g/L，以质量浓度1 g/L考马斯亮蓝R-250进行染色。使用His-tag标签抗体进行Western blot，具体方法参考前期工作[23]。

2 结果与分析

2.1 信号肽来源优化提高TAMEP在E. coli中的分泌表达

在E.coli中，融合于N端的信号肽可介导蛋白质分泌[24]。因此，分别将TAMEP天然信号肽[20]和大肠杆菌pelB信号肽融合至TAMEP的N端，构建得到表达质粒pET22b-TSP-TAMEP和pET22b-pelB-TAMEP(图1)。转化至E.coliBL21(DE3)分别得到重组菌E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)和E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)。

图1 表达质粒示意图Fig.1 The scheme of expression plasmids

将E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)及对照菌E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))于TB培养基中进行诱导表达。诱导温度、诱导起始菌体浓度(OD600)、IPTG浓度和诱导时间，分别为20 ℃、0.8、100 μmol/L和40 h。如图2-a所示，使用TAMEP天然信号肽的重组菌胞外蛋白酶活力达到20.8 U/mL，较pelB信号肽条件下酶活力提高92.6%；由于存在一定量的内源蛋白酶，对照菌仍能检测到一定的蛋白酶活力。由于胞外蛋白酶条带较多，TAMEP的条带在SDS-PAGE电泳图中并不清晰(图2-b)。Western Blot分析结果显示，在E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)、E.coliBL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)发酵上清液中均能检测到条带，且与TAMEP理论分子质量56.4 kDa接近(图2-c)。对照E.coliBL21(DE3)(pET-22b(+))样品，未能检测到相同条带(图2-c)。上述结果表明，TAMEP天然信号肽能有效介导TAMEP在E.coliBL21(DE3)中的分泌，且性能优于E.coli内源信号肽pelB。

a-重组菌胞外TAMEP酶活力；b-重组菌胞外SDS-PAGE电泳；c-重组菌胞外Western BlotM-蛋白质标准分子质量；1-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)；2-E. coli BL21(DE3)(pET22b-pelB-TAMEP)；3-E. coli BL21(DE3)(pET-22b(+))图2 分泌信号肽类型对TAMEP表达的影响Fig.2 Type of signal peptide on the expression of TAMEP注：TAMEP位置用箭头标出

2.2 信号肽N端密码子同义突变提高TAMEP在E. coli中的表达

研究表明，蛋白质N端编码区基因序列对其表达效率有重要影响，但确切的机制尚不清楚[25-26]。为进一步提高TAMEP在E.coli中的表达，基于pET22b-TSP-TAMEP对TAMEP天然信号肽N端前10个氨基酸的密码子进行随机同义突变(图1)，并转化E.coliBL21(DE3)。通过微孔板对1 656个转化子进行初筛，选取了20株蛋白酶活力较高的菌株进行摇瓶复筛。如图3-a所示，20株菌中17株菌的酶活力较E.coliBL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)高；其中，菌株17较出发菌提高了30%，达到了27.0 U/mL。基因序列分析显示，上述17株菌中TAMEP信号肽N端的前10个氨基酸编码基因均发生了不同程度的同义突变。

a-突变株摇瓶发酵上清液TAMEP酶活力;b-突变株TAMEP信号肽N端基因序列WT-E. coli BL21(DE3)(pET22b-TSP-TAMEP)；1-17-TAMEP信号肽N端密码子同义突变体图3 信号肽N端前10个氨基酸密码子同义突变对TAMEP在E. coli中表达的影响Fig.3 Effect of synonymous mutation within first 10 residuesof the TAMEP signal peptide on its expression in E.coli

2.3 提高TAMEP在E.coli中表达的发酵条件优化

为提高TAMEP在E.coliBL21(+)中的表达量，通过单因素实验依次对上述17株菌的诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导起始菌体浓度及添加剂进行优化。如图4所示，对TAMEP分泌表达影响最大的是添加剂，其次为诱导温度和诱导剂浓度；诱导起始菌体浓度对酶表达的影响最小。在所选的添加剂中，乙醇能够刺激细胞热休克蛋白的表达，防止所表达蛋白的错误折叠；葡萄糖可提高宿主细胞中的质粒稳定性；甘氨酸、曲通及吐温等可以改善细胞膜通透性，提高重组蛋白向胞外转运的效率[27]。葡萄糖对TAMEP分泌表达的促进作用最大，表明质粒稳定性可能是其高效表达的限制性因素。最终确定TAMEP在E.coli中高效分泌表达的条件为：诱导温度20 ℃、IPTG浓度为10 μmol/L、诱导起始OD600值为1.5及添加10 g/L葡萄糖。在此条件下，胞外TAMEP酶活力达到186.3 U/mL，较优化前提高了5.9倍。

2.4 TAMEP的纯化及酶学性质研究

本研究中表达的重组TAMEP和前期研究中表达的重组pro-TGase均在C端添加了由6个组氨酸构成的His-tag，故采用镍柱对这2个蛋白进行亲和纯化。经洗脱条件优化，确定TAMEP和pro-TGase洗脱的咪唑浓度分别为50和250 mol/L。如图5所示，纯化的蛋白无明显杂带。经脱盐柱去除咪唑，测定TAMEP比酶活力为437 U/mg。

a-诱导温度TAMEP表达的影响；b-IPTG浓度TAMEP表达的影响；c-诱导起始菌株浓度TAMEP表达的影响；d-添加剂TAMEP表达的影响图4 诱导表达条件对TAMEP表达的影响Fig.4 Effects of induction conditions on the TAMEP expression

M-蛋白质标准分子质量；1-纯化TAMEP 50 mol/L洗脱液；2-纯化pro-TGase 250 mol/L洗脱液图5 SDS-PAGE电泳分析TAMEPFig.5 SDS-PAGE analysis of TAMEP注：TAMEP和pro-TGase位置分别用单箭头和双箭头标出(下同)

对纯化后的TAMEP进行了酶学性质分析。如图6-a和图6-b所示，TAMEP的最适反应温度和最适反应pH分别为55 ℃和7.0。稳定性分析结果显示，TAMEP在30～50 ℃孵育60 min酶活力保持在50%以上，60 ℃孵育相同时间酶活力几乎全部损失(图6-c)；TAMEP在pH 6.2～8.9最稳定，并且在碱性环境中比在酸性环境中更稳定。上述性质与S.mobaraensisTAMEP相似，将有助于高效活化pro-TGase的同时，确保活化后TGase的稳定性。

a-温度对TAMEP催化活性影响；b-pH对TAMEP催化活性影响；c-温度对TAMEP稳定性影响；d-pH对TAMEP稳定性影响图6 TAMEP酶学性质分析Fig.6 Catalytic property analysis of TAMEP

2.5 TAMEP活化pro-TGase

为研究重组TAMEP对pro-TGase的活化，用0.017～0.133 μmol/L TAMEP活化6.91 μmol/L pro-TGase 30 min，每隔10 min取样进行TGase酶活力检测和电泳分析。TGase酶活力分析显示，TGase活性随着活化反应进行而逐渐升高；相同的活化时间下，TGase活性随着加入TAMEP的浓度升高而升高(图7-a)。

如图7-b所示，随着活化反应的进行，pro-TGase(43.4 kDa)迅速转化为TGase(39.2 kDa)，较高浓度TAMEP可加快这个转化过程，并且未产生其他小的蛋白条带。上述结果表明，重组TAMEP能高效催化pro-TGase活化，并不会降解活化后的TGase。

a-TGase酶活；b-SDS-PAGE电泳图7 重组TAMEP的浓度对pro-TGase活化的影响Fig.7 Effect of TAMEP concentration on theactivation of pro-TGase注：SDS-PAGE左侧括号中的数值为TAMEP浓度

3 结论与讨论

重组链霉菌pro-TGase异源表达后，需要高效且专一性强的活化蛋白将其转化为活性TGase。S.mobaraensisTAMEP作为pro-TGase天然活化蛋白，较其他蛋白酶更具优势。本研究，我们将S.mobaraensis来源的TAMEP表达于E.coli，并通过多重优化策略(信号肽类型、N端同义密码子优化、优化诱导条件)，实现了TAMEP的高效分泌表达，胞外TAMEP酶活力达到了186.3 U/mL。与胞内表达相比[20]，高效分泌表达将有助于TAMEP的分离提取，降低产酶成本。酶学性质分析显示，重组TAMEP 与TGase具有近似稳定pH和温度范围，将有助于前者对后者的活化。研究结果为TAMEP规模化生产提供了生产菌株和基础数据。值得注意的是，本研究采用价格较高的IPTG作为诱导剂，同时活化过程中TAMEP不能重复利用。因此，进一步考查自诱导表达的条件及研究TAMEP的固化策略将有助于其工业化应用。