张 涛， 刘 雪， 陈 鹏

(华中农业大学 植物科学技术学院， 武汉 430070)

tRNA是翻译过程中的核心分子，对遗传信息的正确解读起至关重要的作用。tRNA具有高度保守的二级结构和三级结构，而且具有大量由4种基础核苷——U、C、G、A衍化而来的修饰核苷。 这些核苷修饰既可以微妙的方式改变tRNA的局部构型，也可以大范围重组的方式改变tRNA的整体结构[1]。有研究表明，某些修饰的存在可以增加tRNA结构的稳定性，诱导tRNA的正确折叠[2]。

在所有tRNA核苷修饰类型中，甲基化是最常见的修饰。甲基化几乎发生在碱基的所有含氮位置上，此外，核糖的2′-羟基的氧原子、嘧啶第5位C原子、腺苷的第2和第8位的C原子上均可发生甲基化[3]。这些核苷甲基化修饰是由多种甲基转移酶(Methyltransferase, 或MTase)催化的。目前被鉴定的RNA MTase包括60多个成员，数百个同源蛋白，归为4个超家族：1)Rossmann-fold 甲基转移酶(简称RFM)[4]；2)SpoU-TRMD 甲基转移酶(简称SPOUT 甲基转移酶)[5]；3)Radical-SAM甲基转移酶[6]；4)FAD/NAD(p)-结合蛋白[7]。

tRNA甲基转移酶是甲基转移酶中的一种，其命名方式是在Trm或TRMT后加数字或字母。本文综述了负责tRNA上9位和37位鸟嘌呤N1甲基化的甲基转移酶，探讨不同的酶针对不同底物位点的特异性识别机制。

1 tRNA中的m1G修饰

tRNA分子上普遍存在着修饰核苷，很多转录后修饰有助于tRNA的正确折叠，而不同位置及不同类型的修饰可以影响tRNA分子的局部结构、整体稳定性、酶学动力学及最终翻译过程的解码能力[8]。其中，反密码子茎环附近的修饰会直接影响蛋白质翻译过程的效率和准确性[9-10]。

N1-methylguanosine(m1G)是由特定的甲基转移酶特异性识别tRNA鸟嘌呤(G)第一位N原子，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，AdoMet/ SAM)为甲基供体，在识别位点添加一个甲基基团而形成(图1-A)。目前已经在古菌、细菌和真核生物中鉴定到m1G修饰，存在于不同tRNA的第9位或第37位(图1-B)。

A：G在m1G甲基转移酶的作用下形成m1G；B：tRNA第9位和37位G可以甲基化形成m1G

研究表明人类线粒体tRNA的结构缺陷与m1G9修饰功能的缺失有关，源于TRMT10A基因突变或失活[11]。TRMT10A是负责人类tRNA中m1G9修饰的甲基转移酶，TRMT10A的缺陷可导致智力障碍、小头畸形和青春期延迟[11]。

相对第9位的m1G修饰来说，tRNA第37位的m1G修饰有助于密码子的准确识别[12-13]。缺乏m1G37修饰会导致tRNA在翻译过程中可能发生移码突变，最终导致读码框的紊乱[14]。

2 在tRNA中负责m1G修饰的酶

负责tRNA上m1G9和m1G37修饰的甲基转移酶属于SPOUT甲基转移酶家族或RFM甲基转移酶家族，它们均以AdoMet为甲基供体。

自然界中普遍存在SPOUT甲基转移酶，催化形式多种多样，但所有的SPOUT甲基转移酶都具有一个共同的核心结构域——“SPOUT”结构域。迄今发现的所有Trm10蛋白在SPOUT结构域中的氨基酸序列具有整体相似性[15-16]。SPOUT结构域的折叠方式分为Ⅰ型和Ⅱ型(图2)，这两种折叠方式都有着一个类似三叶结(trefoil)的结构。SPOUT结构域的三叶结结构为甲基供体AdoMet提供了结合位点，从而将活化后的甲基转移到底物RNA上，产生甲基化的RNA和S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosine-homocysteine，AdoHcy/SAH)[5]。

图 2 SPOUT甲基转移酶的蛋白拓扑结构Figure 2 Protein domain topology of the SPOUT MTases

RFM甲基转移酶家族包含RNA甲基转移酶和大部分的DNA甲基转移酶[4]。RFM折叠由7个β折叠和分布在β折叠两侧的6个α螺旋构成(图3)。RFM甲基转移酶有单聚体、二聚体、三聚体和四聚体模式，但最常见的是单聚体。大多数RFM甲基转移酶在RFM折叠结构域外包含一个辅助域，这些辅助域整体插入RFM折叠结构中，并在识别底物过程中发挥重要作用[4]。

图 3 RFM甲基转移酶的蛋白拓扑结构Figure 3 Protein domain topology of the RFM MTases

tRNA-m1G9修饰存在于真核生物和古细菌中，在细菌中还没有发现tRNA-m1G9修饰的存在[1]。酵母中负责tRNA-m1G9修饰的甲基转移酶是Trm10p，其同源蛋白在真核生物和古细菌中广泛存在[17]。多细胞动物可以同时存在多个Trm10的同源酶，例如人类细胞中Trm10的3个同源蛋白TRMT10A、TRMT10B和TRMT10C。

细菌中负责tRNA-m1G37修饰的甲基转移酶是TrmD，属于SPOUT甲基转移酶家族；真核生物和古生菌中负责tRNA-m1G37修饰的甲基转移酶是Trm5，属于RFM甲基转移酶家族[18]。下面分别对不同物种中鉴定到的m1G甲基转移酶及其特性进行详细介绍。

2.1 m1G9

如上文所述，负责tRNA-m1G9修饰的甲基转移酶——Trm10酶家族，属于SPOUT甲基转移酶。蛋白晶体结构结果显示，Trm10酶家族由一个非保守的N端结构域，一个SPOUT催化结构域(Ⅱ类亚型)和一个非保守的C端结构域组成。大多数SPOUT家族成员为二聚体蛋白，但是所有的Trm10类同源蛋白的晶体结构都是单聚体[1,19]。虽然蛋白聚合状态不同，但是SPOUT催化结构域本身结构相差无几，有着非常相似的AdoMet结合位点。在二聚体SPOUT蛋白对嘌呤进行修饰时，两个亚基中的SPOUT催化域会同时起催化作用，完成甲基化反应[20]。除SPOUT催化域外，许多SPOUT蛋白的N端或C端结构域对tRNA的结合也起到一定的协助作用[19-23]。嗜酸热硫化叶菌Trm10(SaTrm10)和tRNAMet的嵌合模型表明，SaTrm10的N端结构域和tRNA接受臂相互作用，而C端结构域参与tRNA的结构重塑，使原本位于tRNA内部的第9位腺苷浮出表面，便于甲基化反应的进行[19,24]。但遗憾的是，目前还没有研究获得Trm10蛋白和tRNA结合的晶体结构。

真核生物中的m1G9修饰存在于细胞质tRNA和线粒体tRNA中。在酵母基因组中，tRNA-m1G9修饰的甲基转移酶Trm10p定位于细胞质，Trm10p的缺失对酵母的生存能力没有明显影响，但造成其对5氟尿嘧啶(5FU)敏感，在5FU存在情况下生长严重受阻[17,25]。

人类基因组含有3个Trm10同源蛋白——TRMT10A、TRMT10B和TRMT10C，他们分别定位于细胞质、细胞质和线粒体中。研究表明：TRMT10A在人类胚胎和胎儿大脑中均有表达，基因突变会导致小头症，身材矮小和严重的糖尿病；抑制TRMT10A基因的表达不会损害分泌胰岛素的β细胞的功能，但是会诱导细胞凋亡，对大脑神经元产生负面影响，造成一系列病症的出现[11]。对酵母的异源互补实验说明人类TRMT10A和TRMT10B蛋白具有不同的生物学功能[26]。同时，蛋白体外活性研究表明，TRMT10B与其他Trm10同源蛋白相比，催化tRNA-m1G9的效率较低，但可以同时催化tRNAAsp上m1A9的形成[26]。

TRMT10C和HSD10(一种线粒体代谢酶)形成复合物后才能作为甲基转移酶起作用[27-29]。研究表明，m1G9的形成依赖于TRMT10C活性部位的天冬氨酸残基314(D314)和非活性位点的谷氨酰胺残基226(Q226)[30]。

2.2 m1G37

细菌中负责tRNA-m1G37修饰的甲基转移酶是TrmD，属于SPOUT蛋白家族。在遗传信息解码过程中，m1G37修饰位于反密码子的3′端，对于抑制移码错误起至关重要的作用[31-32 ]。TrmD是一个同型二聚体，每个单体由3个结构域组成：一个N端结构(NTD，即SPOUT结构域)，负责结合甲基供体AdoMet；一个C端结构域(CTD)，负责与底物tRNA的结合；以及一个中间链接器[33-34]。在TrmD-tRNAGlnCUG-sinefungin(简称sfg，AdoMet的类似物)形成的晶体结构中，TrmD二聚体的两个亚基A和B分别与sfg结合，但只有B亚基可以把tRNA-G37定位在中间链接器中，继而发生甲基转移反应[20](图4-A)。甲基转移反应开始前，TrmD B亚基中的天冬氨酸169(D169)从G37 1-NH上接受一个质子，使G37形成脱质子中间态，这种中间态极不稳定，而TrmD B亚基中的精氨酸154(R154)位于tRNA-G37和sfg之间，可以稳定这种中间态，为后续甲基转移做准备[35]。TrmD B亚基与底物tRNA结合时，会先与tRNA-G36相互作用，TrmD B亚基与tRNA-G36的结合可以增强TrmD对tRNA-G37的特异性识别，增强结合之后的结构稳定性[20,36]。随后G37碱基的一部分从反密码子环中翻转出来，插入到TrmD B亚基的N端催化域中，催化域中的天冬氨酸169、精氨酸154侧链与tRNA-G37的1-NH和2-NH2基团结合，从而实现对tRNA-G37的特异性识别[34]。同时，sfg与B亚基NTD结构域中的三叶结深裂缝结合，形成弯曲形状，只有这种弯曲形状的甲基供体才能实现向tRNA 37位鸟嘌呤的甲基转移[35](图4-B)。此外，最近的研究发现 TrmD在甲基化tRNA-G37的过程中还需要Mg2+的参与，Mg2+可以促进甲基转移过程中G37脱质子中间态的形成，同时也作为G37的直接配体起作用[37]。

A：整体结构；B：催化中心

A：整体结构；B：催化中心；C：反密码子环

真核生物和古菌中负责tRNA-m1G37的甲基转移酶是Trm5，属于RFM蛋白家族。Trm5以单体形式存在，晶体结构由结构域1(D1)、结构域2(D2)和结构域3(D3)组成[38]。其中D1保守度较低，D2高度保守，D3为RFM结构域，是催化结构域。詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)MjTrm5-tRNAGlyGCA-AdoMet嵌合模型显示，D2和D3结构域tRNA反密码子环相互作用，其中tRNA的D环和T环夹在Trm5的D2和D3之间，而D1则与tRNA的L型外角相互作用(图5-A)[36]。tRNA的L型外角与D1结构域的相互作用可以增强tRNA在高温下的亲和力，对于高温环境下生存的詹氏甲烷球菌具有重要意义[18]。Trm5的D2～D3结构域包含了特异性识别tRNA-G37所需要的所有元素[18]。甲基化过程中，tRNA中的G37被翻转到D2和D3形成的催化域中，Trm5精氨酸145(R145)和天冬酰胺265(N265)的侧链可以特异性识别鸟苷，同时G37的N1位原子被固定到AdoMet的旁边，便于甲基转移反应进行(图 5-B)。此外，底物tRNA反密码子臂上38-41位的磷酸基和D茎上24-26位的磷酸基形成的结合框架与Trm5的D2和D3相互作用；tRNA C32和A38的碱基相对，并与Trm5脯氨酸322(P322)堆叠在一起，可能是促成G37从tRNA内部翻转到外部的关键结构[18](图5-C)。

3 结论与展望

本文总结了目前已知参与tRNA第9位和37位2种m1G修饰合成的蛋白分类，比较了合成这两个位点的甲基转移酶的不同结构和生化特性，从酶和底物tRNA特异性结合的分子基础，揭示隶属SPOUT和RFM不同家族的甲基转移酶介导tRNA上不同位点的m1G形成的分子机制。

tRNA的正确修饰可以确保tRNA的折叠和有效的翻译过程，还可以使tRNA适应不同的细胞生长环境。由于基因突变导致的tRNA甲基化异常还与人类疾病息息相关，RNA上的甲基化修饰及相关修饰蛋白的功能研究已成为了研究热点之一。随着检测技术的进步和更多物种中RNA上甲基化修饰位点的鉴定，我们对tRNA甲基化修饰的功能也有了新的认知。但是相对动物而言，植物中的研究尚属初步，仍然存在许多未解之谜。

本实验室致力于高等植物中tRNA核苷修饰的功能研究，并取得了重要研究成果[38]。结合m1G37甲基化修饰的研究成果，我们将以拟南芥和水稻为研究材料，结合遗传、蛋白体外生化和植物生理学等研究方法，深入研究m1G9修饰对高等植物生长发育，特别是逆境耐受的影响，希望通过这些研究揭示tRNA-m1G甲基化修饰及其相关蛋白在基因表达调控和细胞代谢途径的影响，为作物tRNA核苷修饰的研究奠定基础。