孟金柱，安清明，赵成刚，赵园园

（铜仁学院农林工程与规划学院，贵州铜仁 554300）

哺乳动物的卵泡是生殖系统的重要组成部分，它在控制发情周期、发情行为，确保卵母细胞能力及后期胚胎存活率、排卵后黄体功能和孕酮合成[1-3]等方面起着重要作用。卵泡颗粒细胞可以特异表达17β-羟基类固醇脱氢酶受体，细胞色素P450芳构化酶受体和FSH等各种激素受体，并且将膜细胞分泌的雄激素转化为雌激素（E2）分泌到卵泡液并输送到血液中，在卵泡的发育过程中起着至关重要的作用[4]。

绵羊[5]、奶牛[6]和猪[7]等多种动物的转录调控机制已经通过转录组测序被发现。对水牛不同大小的卵泡颗粒细胞进行转录组测序，发现免疫调节可能会参与卵泡的成熟和排卵，例如细胞毒性受到自然杀伤细胞的介导、同种异体排斥反应、抗原处理和呈递、趋化因子信号通路等[8]。本研究旨在通过对贵州白山羊优势卵泡和从属卵泡中的颗粒细胞进行转录组测序，筛选出卵泡发育上调相关基因，对筛选促进山羊卵泡颗粒细胞增殖、调控E2分泌的关键因子以及探讨调控优势卵泡被选择的潜在机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集 选取10只1岁龄健康的贵州白山羊，分别注射前列腺素2α（PGF2α）使其同期发情，同时每天使用B超仪检测卵泡直径大小，直到发情出现3 d后，从中挑选3只卵巢卵泡发育较好的山羊屠宰并采集优势卵泡（DF，直径4.5～6 mm）与从属卵泡（SF，直径3～4.5 mm）。用1 mL注射器分别抽取DF和SF中的卵泡液后，剪开卵泡壁，刮取颗粒细胞（GCs）。

1.2 总RNA提取、文库构建及测序 用Trizol法分别提取3只山羊DF及SF颗粒细胞中的总RNA，用RNeasy mini kit （Qiagen）纯化，Agilent Bioanalyzer 2100检测完整性，Qubit 2.0 Flurometer测量浓度后，交由北京诺和致源生物信息科技有限公司进行文库构建、Illumina Hiseq 2500平台测序，获得原始reads。

1.3 数据处理及分析 通过FastQC （http://www.bioinfor matics.babraha m.ac.uk/projects/fastqc/）将获得的原始reads过滤后获得高品质的干净reads。采用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）将干净reads从头组装得到unigenes序列。应用SOAP V2.0平台将获得的unigenes比对到山羊的RefSeq （ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/704/415/GCF_001704415.1_ARS1/）数据库中，获得mRNA。使用DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析并筛选出上调表达基因。使用DAVID软件对得到的上调表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析。

1.4 反转录及引物合成 将转录组测序留存的总RNA反转录为cDNA，反应条件参照产品（北京全式金）说明书进行：42℃孵育15 min，85℃加热5 s，用Primer 5.0设计具有代表性的4个上调表达基因的引物（表1），并使用β-actin作为内参基因，交由北京华大基因有限公司合成。

表1 供试引物序列

1.5 荧光定量PCR鉴定 Real-time PCR用于鉴定转录组测序中贵州白山羊DF与SF颗粒细胞中差异表达上调mRNA的相对表达量。设置5个样本重复和3个技术重复，根据产品说明书构建20 μL PCR反应体系：模板cDNA 4 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR MIX 10 μL，H2O 5 μL，PCR反应程序：95℃预变性1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40个循环。

1.6 统计分析 各基因在DF和SF颗粒细胞中的相对表达量采用2－ΔΔCT来计算，并经β-actin校正后，采用平均值±标准误来表示，应用SPSS17.0软件进行显著性分析。

2 结果

2.1 贵州白山羊卵泡颗粒细胞中上调表达基因的筛选 将测序结果比对到山羊的RefSeq数据库后得到33 896个基因，其中FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）≥1的基因有13 644个。使用DESeq2软件对这13 644个基因进行差异表达分析，设置参数：log2（DF FPKM/SF FPKM）＞0.5，P＜0.05，共获得695个差异表达基因，其中233个表达显著上调基因，聚类分析热图表明样本之间的差异表达基因重复性较好（图1），表2中列出了差异表达倍数最高的10个上调基因及其功能。

表2 贵州白山羊DF和SF中上调基因及其功能分析

2.2 山羊卵泡颗粒细胞中上调基因GO功能富集 通过对233个表达显著上调mRNA进行GO功能富集分析，共分为三大类别44组：参与生物学过程（BP）的基因占72.7%，其中参与RNA聚合酶II启动子转录的正调控过程的基因数达16个；参与细胞组分（CC）的基因占13.6%，其中参与原子核相关功能组分的基因有38个；参与分子功能的基因占13.6%，其中与ATP结合功能相关的基因有24个（图2）。

2.3 山羊卵泡颗粒细胞中上调基因KEGG信号通路分析为进一步获得与促进山羊卵泡发育相关的信号通路，通过kobas软件对上调表达基因进行KEGG信号通路分析，共发现20条通路（图3），在这些通路中，富集最为显著的是核糖体通路。

2.4 山羊卵泡颗粒细胞中上调基因验证结果分析 通过功能分析，最终从上调表达基因中筛选出4个具有代表性的在山羊卵泡发育过程中可能会起正调控作用的基因（表3）。相对荧光定量结果显示，CALM2、TUT7和PDLIM3在DF和SF中的表达趋势与转录组测序结果一致，且TUT7和CALM2在DF颗粒细胞中的表达量显著高于SF（图4）。

3 讨论

表3 抑制贵州白山羊卵泡发育的候选基因

哺乳动物在发育过程中，卵巢上最大的卵泡即未来的优势卵泡持续生长、成熟并排出卵子[9-10]。有腔卵泡的生长表现为通过在时间和空间上的有序组织来促进对促性腺激素的响应，这首先导致卵泡募集，并伴随着卵泡波的出现，然后促进优势卵泡生长成为排卵卵泡[11-12]。本研究通过对贵州白山羊DF和SF颗粒细胞进行转录组测序，筛选出233个上调表达基因。其他研究者也在不同物种中发现卵泡发育相关基因，如陆婷婷等[13]对川中黑山羊大、小卵泡进行转录组测序，发现403个差异表达的基因，其中，显著上调的有281个，显著下调的有122个。郝庆玲[14]对牛（发生偏差前的第一大卵泡）PDF1和（发生偏差前的第二大卵泡）PDF2的研究发现608个差异表达的基因，并从中找出11个与卵泡发育密切相关的基因。沈曼曼[15]研究蛋鸡卵泡发育，发现在小黄卵泡和F6卵泡中差异表达的基因有1 380个，其中，上调基因490个，下调基因890个。

本实验分别对上调表达基因进行GO、KEGG分析，共筛选出4个具有代表性的基因，可能会促进卵泡的发育，荧光定量结果显示，CALM2、TUT7和PDLIM3在DF和SF中的表达趋势与转录组测序结果一致，且TUT7和CALM2在DF颗粒细胞中的表达量显著高于SF。

在小鼠的研究中，TUT7通过介导mRNA的3' 端尿苷化，来消除卵母细胞生长过程中的转录本，对卵母细胞成熟和生育能力都至关重要[16]。在斑马鱼[17]和非洲爪蟾[18]的研究中发现，阻止TUT7的翻译会导致原肠胚在形成过程中发生缺陷，尿苷缺陷型的胚胎不能逐步淘汰坏死的转录本，导致后期合子不能正常转录，而尿苷化会促进转录组重编程，进而驱动早期胚胎的发育转变。钙调蛋白（CALM）是一种普遍存在的Ca2+结合蛋白，调节大量Ca2+敏感的生物事件，包括Ca2+转运、细胞内信号和转录调节[19-20]。转基因小鼠实验证明，过表达细胞核Ca2+-CaM依赖激酶II（CaMKII），心脏肥大发病率显著增加[21]。抑制细胞核内CAMKII的活性使得转基因小鼠的心脏比非转基因小鼠小[22]。此外，CAMKII还参与了细胞凋亡信号的传递，CAMKII选择性抑制剂可显著抑制细胞凋亡[23]。本研究发现，TUT7、CALM在卵泡DF颗粒细胞中的含量显著高于SF中，推测其在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡颗粒细胞的生长，进而会导致卵泡的优势化。关于PDLIM3和LUM在卵泡中的研究尚未见报道，本研究结果显示，PDLIM3在贵州白山羊DF颗粒细胞中的表达量高于SF中，但差异不显著，暗示其可能不是促进卵泡成为优势卵泡的关键调控因子。

4 结论

本研究在贵州白山羊DF与SF中的颗粒细胞获得233个上调表达mRNA。通过功能分析，筛选出2个可能与山羊卵泡发育相关的上调表达基因，并进行荧光定量PCR验证，TUT7和CALM2在DF颗粒细胞中的表达量显著高于在SF颗粒细胞中的表达量，推测这些基因在山羊卵泡发育过程中可能会促进卵泡的发育，最终导致优势卵泡被选择。