张海波，官久强，周建旭，廖晓鹏，郭冬生*，罗晓林*

（1.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000；2.四川省草原科学研究院，四川成都 625014；3.小金县畜牧兽医服务中心，四川小金 624200；4.小金县圣源牦牛养殖专业合作社，四川小金 624200；5.宜春学院继续教育学院，江西宜春 336000）

牦牛作为能适应高原特殊气候的牛种，其与当地的经济、文化和政治等息息相关。牦牛肉因具有较高的营养价值和经济价值在国内外引起广泛关注。牛肉肌内脂肪（IMF）含量是评价肉品质的关键指标之一，直接决定肉的嫩度、多汁性及风味等性状[1-2]。因此，解析IMF在肌肉中的沉积机制对于改善牦牛肉质有着重要意义。牛肉IMF沉积是脂肪酸合成与分解共同作用的结果，受到脂肪酸合成酶与脂肪酸分解酶等相关基因网络的调控。硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1）、固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）、脂肪酸合成酶（FAS）、过氧化物酶增殖激活受体γ（PPARγ）等脂肪酸合成相关基因的表达决定了脂肪酸的合成能力[3-4]，激素敏感脂肪酶（HSL）和肉碱转移酶1（CPT-1）等脂肪酸分解相关基因的表达决定了脂肪酸的分解能力[5-6]。以前的研究多集中在牦牛肉品质及风味物质[7-8]，而较少有关于这些脂肪代谢相关基因调控牦牛不同肌肉组织IMF形成的相关报道。本实验旨在研究牦牛不同肌肉组织的肉品质和脂肪代谢相关基因表达水平，并分析IMF含量与脂肪代谢相关基因表达的相关性，以期为鉴定牦牛肌肉组织IMF沉积的关键调控基因提供基本参数，也为揭示牦牛不同肌肉组织IMF形成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集 于四川省阿坝州红原县选取体重为（211.50±18.77）kg、4岁的健康麦洼公牦牛10头，清晨空腹屠宰，立即采集小黄瓜条、辣椒条和外脊（第12～13胸肋）的肌肉组织样品，经DEPC水清洗后装入无RNA酶的冷冻管中后迅速放入液氮罐中保存，用于组织总RNA的提取，然后测定相关基因的表达。同时采集小黄瓜条、辣椒条和外脊样各300 g，-20℃保存，用于肌肉IMF含量和蛋白质含量的测定。另取小黄瓜条、辣椒条和外脊样品用于剪切力的测定。

1.2 样品分析

1.2.1 肉品质分析 常温解冻-20℃小黄瓜条、辣椒条和外脊的肌肉样品，将肌肉上的结缔组织、脂肪组织和黏膜去除干净，采用索氏脂肪抽提法分析样品IMF含量[1]，并且采用凯氏定氮法《食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5-2016）测定样品的蛋白质含量。参考Baublits等[9]方法测定牦牛肌肉组织样品的剪切力，即切取3 cm×3 cm×2 cm的肌肉组织样品，其中2 cm方向为肌纤维方向，用塑料薄膜袋密封后放入80℃恒温水浴锅加热样品，当中心温度为75℃后保持5 min，室温自然冷却后沿肌纤维方向钻取直径1.27 cm肉柱，每个样品平行取3个肉柱，用C-LM型嫩度仪分析其剪切力，每个肉柱测3个重复后取平均值即为剪切力值。

1.2.2 基因表达分析 采用TRIzol方法[1]提取小黄瓜条、辣椒条和外脊的肌肉样品总RNA，即100 mg肌肉样品加入1 mL TRIzol后匀浆，4 ℃ 10 000×g离心10 min，保留澄清的匀浆液加入0.2 mL氯仿，振荡15 s后静置15 min，4℃ 12 000×g离心15 min，收集上清液加入0.5 mL异丙醇，放置10 min，4 ℃ 12 000 ×g离心8 min，弃上清，用1 mL 75 % 乙醇清洗RNA沉淀，4℃ 7 500 ×g离心5 min后弃上清，晾干RNA沉淀后加入无RNase水溶解沉淀，得到总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）分析样品总RNA的浓度。参考TaKaRa逆转录试剂盒说明书将肌肉样品总RNA反转录为cDNA，即4 μL（400 ng）总RNA加入1 μL随机引物，72℃ 5 min，42℃ 5 min，接着加入MgCl24.8 μL、3.7 μL DEPC水、4.0 μL 5×反转录缓冲液、1.0 μL ImProm-IITMReverse Transcription System、1 μL dNTP，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。采用Primer Premier 5.00软件根据GenBank中公布的牛的基因序列设计β-肌动蛋白、SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ、HSL和CPT-1基因的引物序列（表1）。用美国伯乐CFX96实时定量PCR仪测定基因表达水平。反应体系为20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，6 μL cDNA，10 μL 2×FASt SYBR®Green Master Mix，3.2 μL无菌水。反应程序：95℃ 2 min，95℃ 5 s，58℃ 30 s，40个循环。以β-actin为内参，用2-ΔΔCt计算基因表达量。

表1 引物序列

1.3 统计分析 经SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析后，用Duncan's方法进行多重比较。采用SPSS 19.0统计软件对IMF含量与脂肪代谢相关基因的表达进行相关性分析。结果用平均值±标准差表示。P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 牦牛不同肌肉组织的肉品质分析 由表2可知，外脊的IMF含量显著高于小黄瓜条和辣椒条。小黄瓜条和辣椒条的剪切力显著高于外脊，小黄瓜条的剪切力显著高于辣椒条。3个部位蛋白质含量差异不显著。

2.2 牦牛不同肌肉组织的脂肪代谢相关基因表达水平 由表3可知，外脊的SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ基因表达显著高于小黄瓜条和辣椒条，辣椒条的SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ基因表达显著高于小黄瓜条。外脊的HSL、CPT-1基因表达显著低于小黄瓜条。外脊的CPT-1基因表达显著低于辣椒条。辣椒条的HSL基因表达显著低于小黄瓜条。辣椒条与外脊的HSL基因表达差异不显著。

表2 牦牛不同肌肉组织的肉品质分析

表3 牦牛不同肌肉组织的脂肪代谢相关基因表达水平分析

2.3 牦牛不同肌肉组织的IMF与脂肪代谢相关基因表达的相关性分析 由表4可知，小黄瓜条的SCD1基因表达与IMF含量呈极显著正相关。辣椒条和外脊的SCD1基因表达与IMF含量呈显著正相关。小黄瓜条、辣椒条和外脊的HSL、CPT-1基因表达与IMF含量呈显著负相关。

3 讨论

3.1 牦牛不同肌肉组织间的肉品质分析 牛胴体部位是影响肉质的重要因素之一，肉的嫩度、脂肪含量等肉质指标受不同部位影响较大。IMF含量与肉的口感、风味及嫩度相关，是评价肉品质的重要指标。本实验中，外脊的IMF含量高于小黄瓜条和辣椒条，其含量由高到低依次为外脊＞辣椒条＞小黄瓜条。相比较于小黄瓜条和辣椒，外脊运动相对较少，负荷较轻，因而有利于IMF沉积。亢其鹏等[10]研究结果表明新疆褐牛和加系褐牛外脊中脂肪含量都显著高于肩肉和大黄瓜条。牛蕾等[11]测定了中国西门塔尔牛13个分割部位间的脂肪含量，其含量由高到低依次为外脊＞眼肉＞上脑＞里脊＞辣椒条＞板腱＞大黄瓜条＞脖肉＞米龙＞臀肉＞肩肉＞霖肉＞小黄瓜条。肌肉嫩度是影响牛肉品质的重要因素，而剪切力是反映肌肉嫩度的关键指标，剪切力值越大说明肉的嫩度越差。本实验中，外脊的剪切力低于小黄瓜条和辣椒条，其值由高到低依次为小黄瓜条＞辣椒条＞外脊。外脊的剪切力最低，辣椒条次之，这2个部位运动相较于辣椒肉运动少，肌肉负荷较轻，有助于脂肪沉积，因而肌肉较嫩。本研究中剪切力结果也间接证明了牦牛不同部位的IMF含量由高到低依次为外脊＞辣椒条＞小黄瓜条。

表4 牦牛不同肌肉组织的IMF与脂肪代谢相关基因表达的相关性分析

3.2 牦牛不同肌肉组织间的脂代谢相关基因表达分析首先，IMF沉积受到脂肪合成相关基因表达的调控。SREBP-1和PPARγ是控制脂肪细胞分化的关键调控因子，主要作用是正向调控SCD1、FAS等脂肪代谢相关基因的表达，参与脂肪酸的合成[3-4]。SCD1主要功能是催化饱和脂肪酸（主要包括棕榈酰CoA、硬脂酰CoA等）生成单不饱和脂肪酸的关键酶之一，对肌肉脂肪沉积有着重要调控作用[12]。FAS主要负责催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A生成脂肪酸，是脂肪酸合成的关键酶之一[3]。本实验中，牦牛不同部位的SCD1、SREBP-1、FAS、PPARγ基因表达由高到低依次为外脊＞辣椒条＞小黄瓜条，说明外脊脂肪酸的合成能力比小黄瓜条和辣椒条强，从而外脊IMF沉积能力强于小黄瓜条和辣椒条。李健[13]研究发现西杂牛在背最长肌（外脊）的PPARγ基因表达量高于半腿肌（小黄瓜条）。其次，IMF沉积受到脂肪分解相关基因表达的调控。HSL参与脂肪酸分解的限速酶之一，将甘油三酯水解为游离脂肪酸、甘油和甘油二酯[5]。CPT-1参与脂肪酸的β氧化，是脂肪酸分解的关键酶之一[6]。本实验中，牦牛不同部位的HSL、CPT-1基因表达由高到低依次为小黄瓜条＞辣椒条＞外脊，说明外脊脂肪酸的分解能力比小黄瓜条和辣椒条弱，从而外脊IMF沉积能力强于小黄瓜条和辣椒条。这可能是因为小黄瓜条和辣椒条的运动多于外脊，而运动越多其脂肪分解相关基因表达越高，使脂肪酸分解的越多，进而脂肪酸储存的就越少，故外脊IMF含量高于小黄瓜条和辣椒条。

3.3 IMF含量与脂肪代谢相关基因表达的相关性分析在脂肪合成方面，本实验中小黄瓜条、辣椒条和外脊的SREBP-1、FAS和PPARγ基因表达与IMF含量无显著相关性，这可能是因为IMF含量是数量性状，影响基因比较多，本实验所检测的基因属于微效基因，故影响不显著。但本研究中小黄瓜条、辣椒条和外脊的SCD1基因表达与IMF含量呈显著正相关，这与金世杰等[14]在延边黄牛上的研究结果一致。SCD1基因在成都麻羊和简州大耳羊中3个不同部位肌肉组织（背最长肌、后腿股二头肌及臂三头）中的表达均与IMF含量呈显著的正相关[15]。本研究结果表明，SCD1基因可作为调控牦牛IMF形成的候选基因，并且该基因可能对牦牛肌肉IMF沉积有正向调控的作用。而在脂肪分解方面，本实验中小黄瓜条、辣椒条和外脊的HSL、CPT-1基因表达与IMF含量呈显著负相关。日本和牛肌肉的HSL基因表达与IMF含量呈显著负相关[16]。哈萨克族羊和新疆羊背最长肌的HSL基因表达与IMF含量呈显著负相关[17]。本研究结果表明，HSL和CPT-1基因可作为调控牦牛IMF形成的候选基因，并且该基因可能对牦牛肌肉IMF沉积有负向调控的作用。

4 结论

牦牛不同肌肉部位之间IMF也有较明显的差异，外脊IMF含量最高，其脂肪合成相关基因（SCD1、SREBP-1、FAS和PPARγ）的表达水平更高，脂肪分解相关基因（HSL和CPT-1）的表达水平最低；辣椒条的IMF含量、脂肪代谢相关基因表达次之；小黄瓜IMF含量最低，其脂肪合成相关基因的表达水平最低，脂肪分解相关基因的表达水平最高。SCD1基因正向调控牦牛肌肉组织IMF沉积，HSL和CPT-1基因负向调控肌肉组织IMF沉积。