孙秋艳，林婷婷，杜燕，李丛丛，夏庆祥，李舫*

(1. 山东畜牧兽医职业学院，山东省畜禽抗菌药物使用减量化工程技术研究中心，山东 潍坊 261061;2. 青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109)

家禽养殖业中，养殖场内环境的控制是最重要的环节，细菌可形成微生物气溶胶。许多病原微生物可通过微生物气溶胶进行传播[1-2]，因此控制微生物气溶胶传播的常用方法就是消毒[3-4]。但是不同的消毒模式对消毒效果影响较大，理想的消毒模式具有较好的杀死病原微生物的能力，能有效保持鸡场的环境卫生。当今我国肉鸡养殖笼养模式非常多，有标准化笼养模式，也有地面平养模式和网上平养模式改成笼养模式的。本研究采用FA-3型气溶胶粒度分布采样器，对山东标准化笼养、网上平养和地面平养改建笼养的肉鸡场，其空舍期消毒前后进行空气细菌采样。应用Illumina HiSeq PE250双末端测序法[5-6]，对细菌16S rDNA的V3～V4区进行测序，使用Qiime软件对细菌群落组成进行分析，探讨不同笼养模式的优缺点，分析空舍期消毒剂的有效性，以形成指导家禽生产的笼养模式的生物安全技术规程。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

FA-3型(是型号)气溶胶粒度分布采样器、玻璃纤维滤膜为辽阳市康洁仪器研究所产品。

1.2 鸡舍情况

分别在山东潍坊诸城(Z)、安丘(A)、昌邑(X)各选取一个笼养肉鸡场进行采样，养殖模式均为3层立体笼养，其中鸡场X是标准化笼养鸡场， Z鸡场是地面平养改建，A鸡场是地面网养改建。采样时室外温度均为24～29 ℃，湿度均为55%～70%。

1.3 消毒模式

第1次消毒：清水冲洗后，1∶500戊二醛癸甲溴铵消毒液喷洒消毒鸡舍。

第2次消毒：固体甲醛2 g/ m3舍熏蒸消毒12 h，然后再密闭12 h；第3次消毒：0.5%戊二醛喷洒消毒。

1.4 样品采集

样品采集用3点采样法。采样位置分别为舍内对角线中心中点、离对角线中心中点12 m 等距的2 个点(见图1)。在距地面1.2 m处，用FA-3型气溶胶粒度分布采样器(气流速度28.3 L/min，驱动时间1 h)，采集空舍期消毒前和消毒后的样品，鸡粪清理冲洗完作为消毒前样品数据，消毒后72 h采样作为消毒后样品数据。因此诸城(Z)鸡场消毒前为Z1，消毒后为Z2；安丘(A)鸡场消毒前为A1，消毒后为A2；昌邑(X)鸡场消毒前为X1，消毒后为X2。样品采集时，采样人员与鸡场工作人员均远离采样器。将3个采样点的8层吸附有样品的玻璃纤维滤膜混在一起装入无菌封口聚乙烯袋中，做好标记，0 ℃带回实验室，冷冻备用。

图1 3个舍的采样点位置

1.5 DNA提取与测序

将不同时间采集的8层玻璃纤维滤膜，用PBS作为溶解液进行合并溶解后作为一个样本。浓缩含有微生物的溶解液，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对样本的基因组DNA 进行提取，提取的样本DNA送至北京诺禾致源科技有限公司，应用Illumina HiSeq PE250双末端测序法，对细菌16S rDNA的V3～V4区(341F～806R)进行测序。

1.6 数据分析处理

对Illumina测序的序列进行拼接、过滤、质控、剔除嵌合体，最终得到有效数据(Effective Tags)。用Uparse软件，对所有样品在97%相似度下的有效数据聚类并作为分类操作单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释，分析统计各样本的群落组成。使用Qiime软件计算样品的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、ACE指数、谱系多样性指数(Phylogenetic diversity，PD)、指数的Alpha多样性(Alpha Diversity)值[7]，进行Beta多样性(Beta Diversity)组间差异分析。

2 结果

2.1 样品测序结果

对笼养肉鸡舍空舍期空气中细菌16S rDNA基因的V3～V4区(341F～806R)进行测序，序列信息见表1。从OUT的个数可以看出，鸡场Z、A、X 的OTUs消毒后均比消毒前有所降低。消毒效果最好的是X鸡场，其次是A鸡场，最后是Z鸡场。

表1 样本的序列信息

2.2 细菌群落的α多样性分析

2.2.1 取样深度验证

稀释曲线(Rarefaction Curve)是以随机抽取的序列数据为横坐标，序列对应OTUs的数目为纵坐标构建的曲线，可直接反映测序数据量是否合理，还可间接反映样品中物种的丰富程度。6个样品的稀释曲线如图2所示，曲线已趋向平坦，说明测序数据量渐接近合理，可以反映样品中绝大多数的微生物信息，再增大数据量对新物种的发现贡献很小，因此，此次测序的结果可代表样品的真实情况。

图2 6个样品的稀释曲线

2.2.2 细菌群落的α多样性指数分析

α多样性指数分析是通过Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指数，对单个样品中物种多样性的分析。其中，Shannon指数是指综合物种丰度和物种均匀度两方面因素的多样性指数，其值越大表明样品中物种的多样性越高；Simpson指数体现样品中物种丰度指数，其值越大表明样品中物种的多样性越高；PD指数反映了物种组成的系统进化特征的多样性，其值越大则表示样品中物种越丰富；Chao1指数和ACE指数侧重于体现样品中物种丰富度，其值越大则表示样品中物种越多；取样覆盖率则反映了测序结果是否覆盖了样本物种数。由表2可以看出，Z鸡场消毒后Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指数均大于消毒前，说明消毒后细菌种类反而增多；A鸡场和X鸡场消毒后Shannon、Simpson、Chao1、ACE和PD指数均小于消毒前，但X鸡场α多样性指数降低比较大。

表2 样品的α多样性指数

2.2.3 细菌群落多样性的花瓣图

图3直观展示了6个样品共有6个相同的OTUs，表明消毒剂对这6个物种作用不大，消毒后A鸡场OTUs数量减少，X鸡场OTUs数量显著减少，仅剩1种，Z鸡场消毒后OTUs数量反而增多，表明空舍期消毒效果较好的是X鸡场，其次是A鸡场。

花瓣图中每个花瓣代表一个样品，不同的颜色代表不同的样品，中间的core数字代表的是所有样品共有的OTUs数目，花瓣上的数字代表该样品特有的OTUs数目图3 6个样本的花瓣图

2.3 细菌群落的Beta多样性分析

基于非加权法(unweighted unifrac)和加权法(weighted unifrac)进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis， PCoA)来研究Beta多样性，研究结果见图4。3个鸡场消毒前和消毒后细菌群落组成差异较大，多样性具有明显区分，从图4中可以看出，X鸡场消毒前和消毒后细菌群落组成差异最大，其次是A鸡场，最后是Z鸡场。

图4 Beta多样性的PCoA分析

2.4 细菌群落结构分析

2.4.1 门水平细菌组成分析

各样品在门分类水平上细菌组成分析见图5。6个样品共得到16种细菌类群，变形菌门(Proteobacteria)不论是在消毒前还是在消毒后均是优势菌群，相对丰度87.4%～99.3%，其次是厚壁菌门(Firmicutes)，相对丰度0.33%～17.9%，然后是拟杆菌门(Bacteroidetes)，相对丰度0.1%～8.1%，其他门含量较低。由图5表明，X鸡场消毒后细菌门水平上种类非常少，A鸡场消毒后细菌种类也相应减少，Z鸡场消毒后细菌种类反而增多。

图5 门水平细菌组成分析

2.4.2 属水平细菌组成分析

各样品在属分类水平上细菌组成分析见图6。6个样品共得到95种细菌类群，叶杆菌属(Phyllobacterium)除A鸡场消毒前外均是优势菌群，其次是不动杆菌属(Acinetobacter)和劳尔斯菌属(Ralstonia)。由图6表明，A鸡场消毒前优势菌群消毒后完全消失，X鸡场消毒后细菌属水平上种类非常少，A鸡场消毒后细菌种类也相应减少，Z鸡场消毒后细菌种类反而增多。

图6 属水平细菌组成分析

2.5 细菌丰度聚类分析

为研究消毒前和消毒后禽舍空气中细菌群落结构的差异，根据所有样品在属水平的丰度信息，选取丰度排名前35的属，从物种和样品两个层面进行聚类，绘制成热图，结果见图7。3个鸡舍中，消毒前相对丰度最高的菌群，在消毒剂处理后明显降低，尤其是X鸡场消毒后，热图中未出现红色方块，表明消毒后舍内细菌的含量非常低。但是Z鸡场消毒后出现大面积的红色方块，说明Z鸡场消毒后某些细菌种类开始增多。

纵向为样品信息，横向为物种注释信息；热图对应的值为每一行物种相对丰度经过标准化处理后得到的Z值，即一个样品在某个分类上的Z值为样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值。颜色越红表明丰度越高图7 微生物聚类热图

3 讨论

孙秋艳等[8-9]通过传统的自然沉降法、FA-1型六级筛孔撞击式空气微生物采样器等方法对空气中微生物进行培养时，存在工作量大、自然界微生物培养有限等问题，导致只能检测到部分微生物或特定病原微生物，在种类和数量的分析上存在很大局限性[10]。Illumina HiSeq PE250双末端测序法成功解决了通量低、准确率低、操作复杂等问题，与传统分子生物学方法相比，能够检测到更多的微生物基因信息，更加全面、准确地阐明微生物群落结构特征[11-12]。

X鸡场是标准化笼养鸡场，具有自动清粪设备，自动混合通风，具有数控装备，随时监控舍内温度、湿度等功能，鸡舍规格110 m×13.5 m×3.5 m，舍内地面光滑；Z鸡场是地面平养改建的，人工清粪，纵向负压通风(仍然是老的通风设备)，无数控装备，鸡舍规格110 m×14 m×3.5 m，舍内地面凹凸不平；A鸡场是地面网养改建，人工清粪，纵向负压通风，无数控装备，鸡舍规格120 m×14 m×3.5 m，舍内地面光滑。α多样性指数和花瓣图分析可以看出，Z鸡场消毒后细菌种类反而增多，A鸡场和X鸡场消毒后空气中细菌种类相对于消毒前明显减少，可能由于Z鸡场消毒后，舍内地面凹凸不平，消毒后残留水分较多，有利于微生物滋生，且通风效果不好。可见，空气中细菌种类与通风设施、通风时间、舍内地面及时干燥等因素有关。细菌丰度聚类结果表明，空舍期消毒后，鸡舍中相对丰度最高的菌群，在消毒后明显降低，由此表明，笼养鸡舍空舍期消毒具有一定效果。

Beta多样性是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析。细菌群落的PCoA分析结果表明，3个鸡场消毒前和消毒后群落组成差异较大，多样性具有明显区分，表明消毒具有一定效果。

3个鸡舍均位于山东潍坊，养殖模式均为3层立体笼养，采样时间均为2018年4至5月份，采样时室外温度均为24～29 ℃，湿度均为55%～70%，因此，3个鸡舍所处的环境条件相差不大。通过细菌群落结构分析，在门水平上，变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为三大优势菌群，其中变形菌门的丰度最高；在属分类水平上，A鸡场消毒前优势菌群在消毒后完全消失，消毒后3个鸡场优势菌群为叶杆菌属(Phyllobacterium)，其次是不动杆菌属(Acinetobacter)和劳尔斯菌属(Ralstonia)，因此饲养模式对消毒后致病菌种类没有影响。不论消毒前还是消毒后，不动杆菌属(Acinetobacter)丰度都较高，可引起动物呼吸道感染、败血症、脑膜炎、心内膜炎、伤口及皮肤感染和泌尿生殖道感染等。不动杆菌属在消毒前后空气样本中一直存在，由此说明，3个鸡舍消毒后检测到致病菌与环境没有关系，空舍期消毒可能对其作用不大。所以，建立笼养肉鸡场科学有效的生物安全体系就显得尤为重要。