付腾飞，薛兴阳，孟 江

(1.广州市第一人民医院南沙医院，广东 广州 510000；2.广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095；3.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006)

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜HouttuyniacordataThumb.的新鲜全草或干燥地上部分，具有清热解毒、利尿通淋、消肿排脓的功效，鱼腥草归肺经，善治各种肺痈，常用于肺痈吐脓、痰热咳嗽、热痢热淋以及疮疡肿毒的治疗，也是药食两用的中药植物资源之一[1]。研究发现，从天然植物中提取的生物碱类化学成分具有良好的抗肿瘤功效,其疗效高、耐受性好、毒副作用小，在抗肿瘤治疗领域处于优势地位[2]。鱼腥草中已报道的生物碱类化合物有70多种，药理活性研究显示其具有良好的抗炎、抗病毒、抗血小板聚集、肝保护等方面作用，具有广阔的应用前景[3]。祖国医学将鱼腥草列作“肺痈之要药”，其传统汤药和现代注射液剂型应用于肺癌的治疗显示出良好的临床疗效[4-6]。本研究选取临床常见的5种肺癌细胞(95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460)，研究鱼腥草生物碱类组分对肺癌肿瘤细胞的作用，以期为鱼腥草生物碱类组分应用于肺癌治疗提供实验研究依据。

1 研究材料

鱼腥草药材从广州清平药材市场购得，经广东药科大学刘基柱教授鉴定为三白草科蕺菜HouttuyniacordataThunb。盐酸小檗碱为实验室自制(纯度>98%)。HPD-100型大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司)，人肺癌细胞株95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460保存于广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Gibco公司，MTS试剂盒购自Promega公司(CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 货号G3580)，细胞凋亡Hoechst 33258染色试剂盒购自碧云天公司(产品编号C0003)。

2 研究方法

2.1 鱼腥草生物碱类成分的提取和纯化

干鱼腥草药材4 kg，碎成粗粉，用20倍95%乙醇回流提取，每次2 h，提取2次。回收乙醇，用0.5%HCl溶液调pH=2～3，过滤，滤液用1%NaOH溶液调pH=5～7，静置除去沉淀，继续调pH=9～11，减压浓缩得鱼腥草生物碱粗浸膏。制备20 mg/mL的鱼腥草生物碱上样液，调pH=3.0，取样品液40 mL，以0.5 mL/min的流速通过预处理好的d101-100树脂。静置吸附2 h，用60 mL蒸馏水冲洗，再用10%～90%乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得鱼腥草生物碱浸膏11.375 2 g，得率0.284 4%[7-9]。

2.2 提取物中生物碱的含量测定及工作液的制备

精密称取盐酸小檗碱对照品12.35 mg，置于25 mL容量瓶内，加95%乙醇15 mL，定容摇匀得0.494 mg/mL对照品溶液。分别移取对照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于25 mL容量瓶中，定容至25 mL。用乙醇作空白对照，265 nm处测吸光度，以浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，得回归方程：Y=52.826X+0.057 7，R2=0.999 7。用此方法得浸膏中生物碱含量为65.43%。加入磷酸盐缓冲液配成1 mg/mL的工作液，0.22 μm滤膜过滤，4 ℃冰箱保存。

2.3 MTS实验

复苏置于液氮中的5种肺癌细胞株，隔天换液，细胞生长至80%左右传代，置于37 ℃和5%CO2的细胞孵育箱中培养。镜下观察，分别取对数生长期的肺癌细胞，胰酶消化后，用培养基调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，置于细胞孵育箱中培养。用磷酸盐缓冲液调节鱼腥草生物碱的浓度分别为0 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL,每孔100 μL药液，每个浓度5个副孔，48 h后弃上清，磷酸盐缓冲液洗涤后，加入100 μL培养基，避光加入MTS试剂，每孔10 μL，4 h后用酶标仪检测490 nm波长处的光密度A490，重复3次，计算A490平均值。计算相对抑制率，公式如下，再通过IC50计算软件算出5种细胞的IC50。

相对抑制率(%)=(1-试验组A490/对照组A490)×100%

2.4 形态学观察

根据IC50设置4个浓度(0、1/2IC50、IC50、2IC50)，分别处理5种肺癌细胞，于细胞孵育箱中培养48 h。于倒置显微镜下观察加药前后肺癌细胞形态变化。

2.5 Hoechst 33258染色

取洁净盖玻片，70%乙醇中浸泡5 min后晾干，用磷酸盐缓冲液洗涤1次，接种细胞于六孔板内培养。细胞密度约70%时，取浓度为IC50的鱼腥草生物碱工作液处理细胞，培养48 h。将培养液吸出，加入固定液0.5 mL，固定10 min，吸出固定液，用磷酸盐缓冲液洗涤。加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，5 min后吸去染色液，加磷酸盐缓冲液洗涤2遍，用抗荧光淬灭封片液封片，于倒置显微镜下观察。

2.6 统计学分析

使用SPSS 22.0对实验结果进行分析，实验数据用均数加减标准差(mean±SD)表示，两两比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 研究结果

3.1 鱼腥草生物碱对5种肺癌细胞体外增殖的影响

抑制曲线如图1(SigmaPlot 14绘制)，由图1可以看出，鱼腥草生物碱对这5种肺癌细胞的体外增殖具有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性，不同肺癌细胞对鱼腥草生物碱的耐受程度不同，其中人高转移肺癌细胞95D对该药最为敏感，人大细胞肺癌细胞H460对该药耐受程度最高，相差约4倍。(95D、A549、SPC-A-1、H1975、H460的IC50分别为29.51 μg/mL、72.04 μg/mL、67.94 μg/mL、54.00 μg/mL、130.17 μg/mL)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 细胞形态学观察

如图2所示，正常生长状态下的肿瘤细胞，其形态呈现一定规则，镜下视野光亮明晰，细胞贴壁牢固，边缘充分伸展，少量空泡，使用鱼腥草生物碱处理之后，较低浓度下，可见细胞开始萎缩，细胞体积开始变小，细胞形态开始呈现不规则形状，伪足部分消失。95D细胞是人高转移肺癌细胞，迁移性较强，由于其自身伪足发达，加药处理之后其萎缩变化最显著。随着鱼腥草生物碱的浓度逐步增大，细胞进一步萎缩变小，不贴壁的细胞增多，部分细胞脱落死亡，细胞数量减少，同时可以观察到细胞折光性开始降低，固缩黑斑也增多，这些形态变化证实了鱼腥草生物碱可以抑制肺癌细胞的体外增殖，且呈浓度依赖性。

图2 鱼腥草生物碱处理5种肺癌细胞48 h后形态变化(100×，μg/mL)

3.3 Hoechst 33258染色观察鱼腥草生物碱对肺癌细胞细胞核的影响

Hoechst 33258是一种DNA荧光染料,具有膜透性，与DNA双链中的小沟结合后，在荧光显微镜350 nm紫外光激发下，可以检测到蓝色的细胞核，正常肿瘤细胞经该染料染色后，细胞核呈浅蓝色，圆形或类圆形，可以观察到蓝色颗粒，发生凋亡的肿瘤细胞，其胞膜的通透性增加，程度介于正常细胞核坏死细胞之间，使得染料可以进入细胞，使胞核着染。Hoechst 33258可以使核内凝聚的染色质呈现高亮度的蓝色荧光[10]。从图3染色结果可以看出，正常情况下的肿瘤细胞的细胞核呈蓝色，具有一定规则形状，分别经鱼腥草生物碱以IC50浓度处理48 h后，细胞核碎裂，固缩，致密浓染，呈蓝白色荧光，不同种类的肺癌肿瘤细胞其碎片数、浓染程度不同，其中H1975表现得尤为明显。该染色提示鱼腥草生物碱有可能通过诱导肺癌细胞发生凋亡来抑制其增殖。

图3 鱼腥草生物碱处理5种肺癌细胞48 h后Hoechst染色图(μg/mL)

4 讨论

肺癌是一种对人民群众生命健康构成最大威胁的疾病之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[11]。中医药在治疗肺癌方面发挥着独特作用，尤其是减轻放化疗毒副作用、预防复发转移、提高生活质量以及生存期等方面有显著优势[12]，与表皮生长因子络氨酸激酶抑制剂联用可逆转非小细胞肺癌获得性耐药[13]。鱼腥草含有挥发油、黄酮、生物碱、多糖以及有机酸等生物活性物质，常应用于抗菌、抗炎以及抑制肿瘤细胞的治疗，研究表明其提取物对多种肿瘤细胞有抑制作用[14-16]。本研究对鱼腥草中生物碱类成分的抗肺癌作用进行了初步探究，选取了临床常见的5种肺癌细胞，证实了其对肺癌细胞的广泛抑制作用，并对抑制的量效关系进行了研究，结果表明，鱼腥草生物碱类成分对人巨细胞肺癌细胞95D的抑制作用最为明显，95D细胞为为人高转移肺癌细胞，提示该类成分有可能通过抑制肺癌细胞转移发挥抑制作用。

细胞凋亡是细胞的一种生理性死亡，属基因控制的主动死亡过程[17],当细胞凋亡过程受到影响，细胞群增殖和凋亡平衡被打破，异常细胞增殖速度快于凋亡速度，肿瘤便会形成。细胞凋亡可以反向调控肿瘤的进展过程，通过诱导肿瘤细胞启动凋亡被认为是富有前景的治疗手段[18]。细胞凋亡过程中，核染色质断裂成不同大小的片段，与线粒体等细胞器聚集，被细胞膜包围以后，有许多芽状或者泡状的突起，逐渐分开后，形成凋亡小体[19]。Hoechst 33258染色结果表明加药处理过的肿瘤细胞均出现了凋亡小体，配合加药后肿瘤细胞形态变化，证实鱼腥草生物碱类成分有可能通过诱导肺癌肿瘤细胞凋亡发挥抑制作用，其具体机制有待进一步研究。