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款冬组培快繁技术研究

2020-08-11王杰韩梦豪许琳玉刘仪云许家月陈苏丹

现代园艺·综合版 2020年3期
关键词:愈伤组织组织培养

王杰 韩梦豪 许琳玉 刘仪云 许家月 陈苏丹

摘要:为解决款冬生长周期长的问题,以款冬幼嫩无病虫害侵染的叶片为试材,采用组培快繁技术,对其进行离体培养,包括诱导愈伤组织、叶片增殖培养、生根培养、驯化移栽4个过程。结果表明:最适诱导愈伤组织培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+2mg/LNAA,最适芽增殖分化培养基为MS+0.2mg/L NAA+2.0mg/L zT,最适生根培养基为1/2 MS+0.5mg/L NAA,最适移栽基质为珍珠岩:蛭石:泥炭土=3:1:6。

关键词:款冬;组织培养;愈伤组织;驯化移栽

款冬(Tussilago farfara L)为菊科款冬属多年生草本植物,别名冬花、九九花,头状花序,花期2~3月。款冬花为我国传统中药材,历代《中国药典》均有收载。其性温、味辛、微苦、归肺经,具有平喘、升压、抗炎、抗肿等功效,临床使用十分广泛。近几年,环境污染所带来的一系列问题成為人们关注的热点,尤其是雾霾天气引发的健康问题更是令人焦虑。人体吸入空气中的杂质和有毒气体,导致咳嗽、呼吸困难等呼吸道疾病,严重影响着人们的身体健康。研究表明,款冬能有效地缓解上述并发症,有止咳、化痰、润肺之功效。但目前款冬花野生资源遭受严重的破坏,且人工栽培周期长,种植面积少,导致市场供不应求。本试验以款冬为试材,建立完整组培体系,以期为进一步的工厂化、规模化生产育苗提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验地概况

试验于2018年9月~2019年6月在河南省洛阳市河南科技大学(112°24E,34°35N,)进行。洛阳市位于暖温带地带,属大陆性气候。洛阳市年平均温度为11~24%,与款冬天然生长气候环境大致相同。

1.2试验材料

款冬采集于河南省三门峡市卢氏县,并移栽至河南科技大学开元校区统一管理。

1.3方法

1.3.1叶片的消毒处理。试验采用生长旺盛、无病虫害侵染的幼嫩叶片。先用淡洗衣粉水浸泡5min,轻微搅拌,然后流水冲洗0.5h,除去残余。款冬叶片表面覆盖细小绒毛,灭菌较为困难,因此用棉签轻轻擦拭表面可以使消毒剂达到良好效果。本试验设置75%乙醇、0.1g/L HgCI2分别处理30s、300s。

1.3.2培养条件。选用MS、1/2MS为基本培养基,培养基中加入浓度为30g/L蔗糖,8g/L琼脂,培养基pH值5.6~6.4。培养条件为:光照强度2500~3100Lx,光照时间12hid,培养温度22±3℃。

1.3.3诱导愈伤组织。将处理好的叶片在超净工作台上切成约1cm2的小正方形,接种于附加不同激素浓度6-BA、NAA的愈伤组织诱导培养基上。每组接种30瓶,每瓶接种3小块叶片,在22±3℃光培养40d,诱导期间观察其生长情况。

以MS培养基为基本培养基,附加不同浓度的6-BA(0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L),NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L)共9组处理,上述各处理培养基均添加适量30g/L蔗糖、7g/L琼脂。培养基pH值5.6~6.4。

1.3.4芽的增殖培养。选取生长良好的愈伤组织进行芽的增殖分化,将其接入附加不同浓度6一BA、NAA、zT的培养基上。每组处理接种30瓶,每瓶接种1块愈伤组织。在22±3℃、光周期12h/12h(光,暗)的条件下培养30d,培养期间观察其芽的增殖情况。以MS培养基为基本培养基,附加不同浓度的6-BA(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L),NAA(0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L),ZT(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L)共8组处理,上述各处理培养基均添加适量30g/L蔗糖,7g/L琼脂。培养基pH值5.6~6.4。1.3.5生根培养。选取健壮饱满的芽进行生根培养,以MS为基本培养基,附加不同浓度NAA(0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L),每组处理均添加0.5%活性炭,30g/L蔗糖,7g/L琼脂,pH值5.6~6.4,培养30d,期间观察根的生长情况。

1.3.6驯化移栽。将根长势健壮的组培苗移人室温中,在1周之内将其瓶盖慢慢打开,再完全打开放置2~3d,取出苗洗净根部培养基。在4%高锰酸钾溶液中浸泡根部10s,移栽至珍珠岩:蛭石:泥炭土=1:1:1与珍珠岩:蛭石:泥炭土=3:1:6的2种不同基质配比中,每组处理10瓶。保持温度22±3℃,含水量(95±5)%,适当遮荫与通风,计算成活率。

2结果与分析

2.1不同植物激素对诱导愈伤组织的影响

接种3周后观察,叶片四周有明显膨大卷曲现象,大部分叶片边缘形成黄绿色的凸起物。1mg/L 6-BA浓度中长势最好;浓度为1.5mg/L 6-BA培养基中出现少量“烧苗”现象。在第6周观察时发现,浓度为0.5mg/L6-BA愈伤组织较致密,但长势弱,不具备芽的增殖分化能力;浓度为1.5mg/L 6-BA出现“烧苗”现象;浓度为1.0mg/L 6-BA培养基中诱导愈伤组织致密;浓度为1.0mg/L 6-BA,0.2mg/L NAA最为突出,愈伤组织呈现出颜色淡黄绿色,致密且强壮。经分析表明,MS+I.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA是较为理想的诱导愈伤组织培养基,诱导率为90.2%,愈伤组织呈黄绿色,强壮且致密,有较强的芽增殖分化能力。试验结果如表1所示。

2.2不同植物激素对芽的增殖分化的影响

将长势良好的愈伤组织转入芽的增殖分化培养基上,2周之后观察并记录其芽诱导率。如表2所示,试验结果表明,不同浓度的6-BA和ZT分别和NAA配比,在一定的浓度范围内,芽的诱导率均呈现先上升后下降。以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA的培养基,芽数量多且健壮,基部无或有少量愈伤组织,生长情况良好,诱导率最高达65.21%。

2.3不同植物激素对生根培养的影响

当芽长到3cm左右,移人生根培养基,20d后根长有明显的伸长情况。在第4周时对试验材料进行观察记录。如表3所示,浓度为0.1mg/L NAA时平均根长最短且根较弱;浓度为0.5mg/L NAA时平均根长最长且根较健壮,达3.2cm;浓度为1.0m~LNAA时试管苗平均根长达2.6cm,且大部分培养基中存在少量愈伤组织。以上结果表明,诱导试管苗生根最适培養基为1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5%活性炭,试管苗平均根长为3.2cm,根生长健壮,根部无或有少量愈伤组织。

2.4不同基质配比对驯化移栽影响

当平均根长达到3.2cm时,对其进行驯化移栽,30天后观察并记录成活率。如表4所示,发现2种基质都较为适合试管苗的移栽,但珍珠岩:蛭石:泥炭土=3:1:6的基质成活率更高。

3结论与讨论

在处理款冬叶片时,因其背部覆细小绒毛,会影响消毒剂的消毒效果,需用棉签擦拭表面,还可将吐温-80加入75%酒精进行处理。两者相比,棉签使用更方便,去除绒毛较彻底,效果更明显。在款冬叶片诱导愈伤组织时期,得出适宜的培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA,与王贵军试验结果相比较,其诱导愈伤组织最适培养基为MS+I.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。两者结果有较小的差异,其原因可能为款冬的产地不同,生长环境不同,栽培种类不同。在此期间发现,部分愈伤组织出现“褐化”现象,出现“褐化”的原因与品种、培养基、取材季节等都有一定关系,其严重程度与酚类化合物的代谢有关,酚类化合物含量越高,“褐化”现象越严重。植物激素NAA可以在一定程度上阻碍酚类化合物的合成,缓解“褐化”的程度。

在芽的增殖分化时期,本试验采用2种不同培养基进行培养,一种是以MS为基本培养基附加不同浓度配比的NAA与6-BA,一种是以MS为基本培养基附加不同浓度比例的NAA与ZT。试验发现,2种培养基在一定浓度范围内对芽的增殖分化都有一定的促进作用,但以MS+2.0mg/L ZT+0.2mg/L NAA生长效果最好,试验结果与任继文等的报道结果类似。

在生根培养中得出最适培养基为I/2MS+0.5mg/LNAA+0.5%活性炭,与王贵军研究报道结果相同。基质的种类及其配比是影响款冬组培苗驯化移栽生长的重要因子,泥炭土具有巨大的吸水与保水能力,珍珠岩稳定性强,吸水性好,可以疏松土壤使根系透气。蛭石透气性好,温度变化小,有利于稳定根系的环境温度。采用这3种基质有利于款冬的生长。从此次试验得出,驯化移栽最适基质比例为珍珠岩:蛭石:泥炭土=3:1:6,成活率高达89.72%,这与韦如萍研究结果不同。出现差异的原因是不同科属的植物生长习性不同,对需水量及需氧量不同,所以对不同基质的需求量不同。

本试验建立了完整的款冬组培体系,极大地缩短了其栽培周期,为工厂化育苗提供理论依据,在一定程度上可缓解款冬野生资源紧张,满足市场的巨大需求。

(收稿:2019-09-16)

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