陈宇 卢森华 庞小莲

摘要：建立超高效液相色谱-串联质谱法同时检测中成药和保健食品中非法添加的7种治疗高尿酸血症类药物的方法。色谱柱为ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.2%甲酸水溶液-乙腈（流速为 0.3 mL/min）为流动相梯度洗脱;质谱采用电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测（MRM）模式进行定性定量分析。结果表明，7种治疗高尿酸血症类药物在相应的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0. 995，在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为95.49%～104.87%，RSD为1.40%～3.44%，检出限为0.01～0.30 μg/kg，定量限为 0.04～1.00 μg/kg，6批样品中有1批样品检出了非法添加的化学物质。该方法前处理简单，灵敏度高，结果准确，适用于中成药和保健食品中7种治疗高尿酸血症类药物的同时快速定性定量分析。

关键词： UPLC-MS/MS;中成药;保健食品;非法添加;高尿酸血症药物

Abstract： To establish a method for simultaneous detection of 7 hyperuricemia drugs for treatment illegally added to Chinese patent medicines and health foods by UPLC-MS/MS.The samples were extracted from samples with mobile phase，the column was a ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），a gradient elution with the mobile phase of 0.2% formic acid aqueous solution and acetonitrile solution at a flow rate of 0.3 mL/min. The compounds were detected by electrospray ion source in positive mode with multiple reaction monitoring （MRM） mode.The results showed that all the 7 hyperuricemia drugs for treatment with showed good linearity in their reasonable ranges ，and the correlation coefficients  were greater than 0.995.The average recoveries of low， medium and high concentrations ranged between 95.49% and 104.87%，and the relative standard deviations were 1.40%～3.44%. The LODs were 0.01～0.30 μg/kg and LOQs were 0.04～1.00 μg/kg.Illegal added chemical drugs were found in 1 of the 6 tested practical samples. With the advantages of simple pre-processed，high sensitivity  and accurate results，the method can be used in determination of 7 hyperuricemia drugs for treatment in Chinese patent medicine and health foods.

Key words： UPLC-MS/MS; Chinese patent medicine; health food; illegal addition; hyperuricemia drugs

高尿酸血症是以体内嘌呤代谢紊乱、血尿酸增高为主要特征的病症，中国的患病率在8.4%～13.3% [1]，并呈逐年上升和年轻化趋势，不仅可诱发痛风、尿石症、慢性肾病等疾病，还与肥胖、高血压、高血糖和血脂紊乱等代谢综合征密切相关，痛风是其最常见的诱发疾病，目前中国的痛风患病率在1%～3%[2]。研究表明，不法商家为了追求利益在产品中非法添加化学药物。普遍认为中成药具有毒副作用小，长期服用可降低高尿酸血症引起的慢性病风险，有些保健食品也打着纯天然的旗号宣称能降尿酸治痛风，不法商家利用患者信任中药、保健食品又急于治病的心理，在中成药、保健食品中非法添加治疗高尿酸血症或止痛的化学药物牟取暴利，但长期服用或超剂量服用含有化学药物的中成药或保健食品会对身体造成严重毒副作用或延误治疗时机，并发其他慢性病甚至會危及生命[3-5]。目前，针对中成药和保健食品中非法添加剂的检测方法主要有液相色谱法和串联液质联用法[6-19]。抗痛风类、风湿类非法添加剂大多是以消炎止痛类药物为主，张秋炎等[12]报道了非法添加丙磺舒、非布司他等9种尿酸调节类药物的LC/MS/MS方法，但是常用来缓解痛风症状的秋水仙碱和促尿酸排泄的苯溴马隆未见报道。本试验建立了同时测定中成药和保健食品中非法添加秋水仙碱、苯溴马隆、非布司他、丙磺舒、地塞米松、醋酸泼尼松、吲哚美辛等7种治疗高尿酸血症类药物的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），可为食品药品监管部门日常监管提供技术支撑，打击不法商家在中成药和保健食品中非法添加治疗高尿酸血症类药物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试药

对照品：苯溴马隆（Standford Chemicals，批号AL180726-25，含量98.13%）、丙磺舒（Standford Chemicals，批号为AL181019-01，含量98.07%）、非布司他（Standford Chemicals，批号为YT180112-06，含量99.95%）、地塞米松（Dr.EhrenstorferGembH，批号为100941，含量98.90%）、吲哚美辛（中国食品药品检定研究院，批号为100258-200904，含量99.90%）、醋酸泼尼松（中国食品药品检定研究院，批号为100012-201407，含量99.50%）、秋水仙碱（中国食品药品检定研究院，批号为101176-201202，含量93.60%）;乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

6批样品购自药店或私人诊所，均能治疗痛风或降低尿酸，分别是保健食品1批，枸杞蚂蚁追风胶囊（郑州万隆生物科技有限公司，批号无）;中成药3批，复方风湿宁胶囊（广东罗浮山国药股份有限公司，批号为L16K052）、追风透骨胶囊（湖南德康制药有限公司，批号为161003）、鹿川活络胶囊（河北万岁药业有限公司，批号为160907），诊所自制2批，保健药酒、神效丸。

1.2 仪器

ACQUITY UPLC I-Class/TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾离子源及Masslynx 4.1数据处理系统），美国Waters公司;3K15高速冷冻离心机，德国 SIGMA 公司;HYQ-3110型涡旋混匀器，美国精骐公司;XS-205Du型电子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱温为40 ℃;流速为0.25 mL/min;进样量为5 μL。流动相A为乙腈，流动相B为含0.2 %甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0～1 min，55%A;1～5 min，55%A→15%A;5～5.5 min，15%A→55%A;5.5～7 min，55%A。

1.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子（ESI）源，正离子模式;毛细管电压为3.0 kV;离子源温度为120 ℃;脱溶剂气温度300 ℃;RF透镜电压为0.5 V;脱溶剂气流速为600 L/h;锥孔气流速为50 L/h;采集模式为多反应离子监测（MRM）采集，监测离子参数见表1，7种标准物质的提取离子（定量）质谱见图1。

1.3.3 标准品储备液的制备 精密称取苯溴马隆标准品10.49 mg、丙磺舒标准品11.04 mg、非布司他标准品10.45 mg、地塞米松标准品10.69 mg、醋酸泼尼松标准品10.27 mg、秋水仙碱标准品10.40 mg、吲哚美辛标准品11.53 mg，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇溶液适量，超声溶解并定容至刻度，摇匀，再从中精密量取0.1 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为标准品储备液。

1.3.4 混合标准品溶液的制备 精密量取秋水仙碱标准品储备液0.4 mL、地塞米松标准品储备液2.0 mL、醋酸泼尼松标准品储备液1.0 mL、丙磺舒标准品储备液0.4 mL、吲哚美辛标准品储备液0.6 mL、非布司他标准品储备液0.1 mL、苯溴马隆标准品储备液0.4 mL，置同一20 mL容量瓶中，用含0.2%甲酸的乙腈-水（45∶55）溶液定容至刻度，即得混合标准品溶液（每1 mL溶液中含秋水仙碱0.194 68 μg，地塞米松1.057 2 μg，泼尼松0.510 95 μg，丙磺舒0.216 54 μg，吲哚美辛0.345 55 μg，非布司他0.052 225 μg，苯溴马隆0.205 88 μg）。

1.3.5 供试品溶液的制备 取一次口服用量的样品，置10 mL具塞离心管中，精密加入10 mL含0.2%甲酸的乙腈-水（45：55）溶液，涡旋混匀1 min，超声10 min，以10 000 r/min离心5 min，取上清液，过0.22 μm有机微孔滤膜，取滤液待测。

1.3.6 线性关系考察 分别精密吸取混合标准品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置10 mL容量瓶，用含0.2%甲酸的乙腈-水（45∶55）溶液定容至刻度。按“1.3.1”“1.3.2”色谱和质谱条件测定。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

线性关系考察结果见图2，以进样浓度（X）为横坐标，响应值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，计算各自的回归方程和线性范围，外标法定量。以最低信噪比S/N =3和S/N=10分别计算7种治疗高尿酸血症类药物的检出限（LOD值）和定量限（LOQ值）。7种治疗高尿酸血症类药物在相应的浓度范围内线性关系良好，灵敏度较高，相关系数均大于0. 995，检出限为0.01～0.30 μg/kg，定量限为 0.04～1.00 μg/kg（表2）。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密吸取同一混合标准品溶液5.0 μL，连续进样7次测定，秋水仙碱、地塞米松、醋酸泼尼松、丙磺舒、吲哚美辛、非布司他、苯溴马隆7種治疗高尿酸血症类药物响应值的RSD分别为1.8%、1.0%、0.6%、0.8%、3.6%、1.6%、2.9%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 稳定性试验 精密吸取5.0 μL混合标准品溶液，分别于0、1、2、4、6、12 h进样，测定其响应值并计算含量，秋水仙碱平均含量为11.574 ng/mL，RSD为1.3%，地塞米松平均含量为69.349 ng/mL，RSD为1.3%，醋酸泼尼松平均含量为33.734 ng/mL，RSD为1.1%，丙磺舒平均含量为13.351 ng/mL，RSD为1.6%，吲哚美辛平均含量为21.100 ng/mL，RSD为3.9%，非布司他平均含量为3.931 ng/mL，RSD为4.0%，苯溴马隆平均含量为12.120 ng/mL，RSD为4.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.3 加样回收试验 精密称定复方风湿宁胶囊6份，每份约1.0 g，置10 mL具塞离心管中，在低、中、高3個加标水平下分别进行加标回收试验，依次精密加入0.1、0.1、0.2、0.2、0.5、0.5 mL混合标准品溶液，加含0.2%甲酸的乙腈-水（45∶55）溶液，涡旋混匀1 min，超声10 min，以10 000 r/min离心5 min，过0.22 μm有机微孔滤膜，取滤液。分别进样5 μL，记录秋水仙碱、地塞米松、醋酸泼尼松、丙磺舒、吲哚美辛、非布司他、苯溴马隆7种治疗高尿酸血症类药物的响应值并计算回收率，结果见表3。由表3可知，在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为95.49%～104.87%，RSD为1.40%～3.44%，

2.3 样品的测定

采用所建方法对6批次治疗高尿酸血症类药物进行测定，每份取一次口服用量，按“1.3.5”方法制备供试品溶液，分别进样5.0 μL，测定其响应值并计算秋水仙碱、地塞米松、醋酸泼尼松、丙磺舒、吲哚美辛、非布司他、苯溴马隆7种治疗高尿酸血症类药物的含量，结果见表4。由表4可知，6批样品中只有枸杞蚂蚁追风胶囊非法添加地塞米松，其他样品均未检出。

3 讨论

本研究比较了0.1%、0.2%甲酸-乙腈体系与0.1%、0.2%甲酸-甲醇体系流动相，结果发现0.2%甲酸-乙腈体系作为流动相时，响应较高，梯度洗脱程序能很好地将7种化合物分开。加入0.2%甲酸时化合物的离子化效率比0.1%时好，质谱响应值更高。收集到的6批样品有药酒、胶囊和丸剂，7种治疗高尿酸血症类药物的化学结构和性质差别也较大，在提取过程中目标成分的溶出和溶解度都不一样。分别考察了甲醇、乙腈、甲醇-水（50∶50）、乙腈-水（50∶50）体系的提取效果，结果发现，以甲醇、甲醇-水（50∶50）提取时基质干扰较大，可能是甲醇体系将一些极性较大的物质一并提取造成的;用乙腈提取时个别目标化合物回收率过低，可能是在纯有机相中溶解度太低所致，改用乙腈-水（50∶50）提取回收率明显提高;考虑到与流动相初始比例相近，而且加入0.2%甲酸可明显改善电离提高响应值，因此选择乙腈-0.2%甲酸水（45∶55）溶液为提取溶剂，回收率得到进一步提高。超声提取时间分别考察了5、10、15、20、30 min，胶囊内容物较快溶散，在5 min即提取完全，丸剂是剪成小块后提取，10 min也溶散完全，本试验选择提取时间为10 min，实际检测中不同的剂型样品可适当延长超声提取时间。中成药和保健食品中成分复杂、剂型多样，质谱分析尤其是电喷雾质谱分析存在基质效应，主要是由于样品基质中存在磷脂质、胆固醇及其脂和蛋白等内源性物质引起的[20]，影响方法的灵敏度、精密度和准确度。为消除或补偿基质效应给定量带来的偏差，可以用稳定同位素内标[21，22]，固相萃取净化[23，24]，但是以上方法成本较大，本研究采用配制空白基质匹配标准溶液的方法绘制标准曲线消除基质效应。

研究建立了同时快速测定中成药和保健食品中7种非法添加治疗高尿酸血症药物的新方法，包含了临床治疗常用的药秋水仙碱、苯溴马隆、非布司他和丙磺舒。从收集到的6批次样品检测结果和文献报道[6-12]的检测结果观察，目前用于高尿酸血症的中成药或保健食品非法添加主要还是以缓解痛风症状的抗炎止痛药物为主，由于效果明显更容易获得消费者的青睐，而随着高尿酸血症、痛风诊疗技术和药物应用的发展[25]，对高尿酸血症的降尿酸药物应用越来越广泛，在今后的中成药、保健食品监管中有可能会遇到以降低尿酸水平为卖点的产品。本研究所建立方法前处理过程简单，净化效果好，专属性强，目标物回收率稳定，分析速度快，可满足实际样品检测的需要，可作为该类产品监管的重要技术储备，改变以往监管技术落后于监管需求的现状。

参考文献：

[1] 丁小强， 冯 哲， 倪兆慧， 等.  中国肾脏疾病高尿酸血症诊治的实践指南（2017版）[J]. 中华医学杂志，2017，97（25）：1927-1936.

[2] 曾小峰，陈耀龙. 2016中国痛风诊疗指南[J]. 中华内科杂志，2016，55（11）：892-899.

[3] 罗 珺，陈庭强. 保健食品安全风险监管行为激励相容机制研究[J]. 食品工业，2019，40（1）：255-259.

[4] 王爱华，金 玥，吴 越，等. 具有黄嘌呤氧化酶抑制作用的中药及中成药治疗高尿酸血症研究进展[J]. 天津中医药，2019，36（12）：1241-1245.

[5] 黄胜男，王如然，张 颖，等. 高尿酸血症及痛风患者用药特点的横断面调查[J]. 医学综述，2019，25（4）：805-810.

[6] 张少敏，陈 斌，凌善文，等. 非法添加抗痛风类化学药检测方法的研究[J]. 药学服务与研究，2012，12（3）：199-201.

[7] 杨园园，许乾丽. HPLC测定抗风湿、痛风类保健品中激素类化学药的含量[J]. 黔南民族医专学报，2015，28（1）：14-17.

[8] 陈银华，徐 凡，李海霞，等. 痛风灵散中非法添加吲哚美辛和醋酸泼尼松的检测研究[J]. 长江大学学报（自科版），2018，15（8）：9-12.

[9] 龙玉琼，汤 珺. HPLC法快速筛查抗痛风类中成药非法添加的6种化学药品[J]. 中国中医药现代远程教育，2018，16（2）：93-95.

[10] 赵 琪，钱叶飞，贾昌平，等. UPLC-DAD快速筛查抗风湿类保健食品及中成药中非法添加的19个化学物质[J]. 药物分析杂志，2019，39（12）：2171-2177.

[11] 勇艳华，李 鹏，边海涛，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定痛风类中成药中17种非法添加物[J]. 中国卫生检验杂志，2019，29（22）：2711-2714.

[12] 张秋炎，罗辉泰，黄晓兰，等. 液相色谱-串联质谱法同时测定中成药与保健食品中非法添加的 9 种尿酸调节类药物[J]. 分析测试学报，2018，37（9）：989-994.

[13] ZOU T T， YANG J Y，XU Z L，et al. Detection of tadalafil and its analogues in health wine and oral liquid by microwell lateral flow immunochromatography assay[J]. Chinese journal of analytical chemistry，2019，47（8）： 1249-1257.

[14] TANG W Y，HUANG Z W，QIAN G S，et al. Determination of 63 compounds illegally added in tea， substitute tea and beverage foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chinese journal of chromatography，2018，36（12）：1245-1260.

[15] SHANG J C，HE X Q，XI C X，et al. Determination of the potential illegal addition of β-blockers to function foods by QuEChERS sample preparation and UPLC-MS/MS analysis[J]. Food additives and contaminants，2015，32（7）：1040-1048.

[16] 徐敦明，赖国银，陈 燕，等. 固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健食品中21种非法添加化合物[J]. 色谱，2019，37（7）：778-785.

[17] 冯 睿，胡 青，孙 健，等. UHPLC-QQQ-MS法测定食品中30种非法添加调节消化功能类化合物[J]. 上海预防医学，2019，31（6）：432-438.

[18] 孙 晓，田仁芳，董 靖，等. 高效液相-质谱联用法测定改善睡眠类保健食品中的非法添加物[J]. 安徽医药，2019，23（6）：1087-1090.

[19] 曹晓琴，方振峰，张 涛，等. TLC-UPLC-MS/MS法检测网红保健品中非法添加的8种化学药物[J]. 食品科学，2019，40（16）：335-342.

[20] PITA J C L R， GOMES I F ， SANTOS S G D，et al. Matrix effect and optimization of LC-MSn determination of trachylobane-360 in mice blood[J]. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2014， 100：262-270.

[21] KUANG H X，LI Y H，JIANG W H，et al. Simultaneous determination of urinary 31 metabolites of VOCs， 8-hydroxy-2‘-deoxyguanosine， and trans-3-hydroxycotinine by UPLC-MS/MS： 13C- and 15N-labeled isotoped internal standards are more effective on reduction of matrix effect [J].  Analytical and bioanalytical chemistry，2019，411（29）：7841-7855.

[22] PETROSINO T，SERAFINI M. Matrix effect in F2-isoprostanes quantification by HPLC-MS/MS：A validated method foranalysis of iPF2α-III and iPF2α-VI in human urine [J]. Journal of Chromatography B，2014， 965：100-106.

[23] LINDEGARDH N， ANNERBERG A， WHITE N J， et al. Development and validation of a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric method for determination of piperaquine in plasma stable isotope labeled internal standard does not always compensate for matrix effects[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008， 862（1-2）：227-236.

[24] GUO W L，LI G，YANG Y X，et al. LC-MS/MS analysis of pramipexole in mouse plasma and tissues： Elimination of lipid matrix effects using weak cation exchange mode based solid-phase extraction[J].  Journal of Chromatography B，2015，988：157-165.

[25] 郭 韻，王晓非. 痛风的诊治现状及展望[J]. 中国实用内科杂志，2018，38（12）：1127-1130.